手十二井穴刺络放血疗法（井穴刺络法）作为中医传统的急救促醒技术，自《黄帝内经》记载始，便广泛用于尸厥、中风等昏迷急救。本课题组前期临床研究已证实，井穴刺络法对急性重度创伤性脑损伤（traumatic brain injuries，TBI）^[1-2]、脑卒中^[3-4]、急性一氧化碳中毒^[5]等多种中枢神经损伤（central nervous system injury，CNSI）后的意识昏迷状态均有显著的改善作用，且其在井穴刺络兴奋脑干网状上行激活系统（ascending reticular activating system，ARAS）促进TBI大鼠苏醒机制研究中已取得突破性进展^[6-9]。尽管井穴刺络法对CNSI性昏迷促醒有确切疗效，也明确相关神经环路介导了井穴刺络法促醒的效应，但研究仅限于局部的神经活动，且临床中CNSI性昏迷患者病情多较重，难以配合长时间的影像学检查，因此，井穴刺络法治疗CNSI性昏迷产生促醒效应的整体中枢响应特征尚不明确，使其在实际应用和推行中受到一定限制。本研究旨在设计一个试验方案，利用临床影像学技术分析井穴刺络法的整体中枢响应特征，初步探讨该法对醒觉相关环路的调控作用。

1 资料与方法 1.1 一般资料

在天津中医药大学师生中招募30例健康志愿者为受试对象。由于目前尚无临床试验来探讨井穴刺络法对健康人群脑功能应答的影响，且人体fMRI研究与一般的临床研究不同，因此样本量的计算方法不能在一般的临床试验中直接套用。另外，在关于fMRI研究样本量的计算方面，国内外尚无明确标准。本研究参考文献及专家调研，期望25例，考虑20%脱落率，因此总样本30例。

1.2 纳入与排除标准 1.2.1 纳入标准

① 年龄20~50岁，性别不限；②BMI 18.5~23.9 kg/m²；③健康体检项目正常，无器质性疾病史，无肝、消化道、心、脾、肾、肺病史，无神经系统病史，无血液系统疾病，无慢性躯体疾病，无长期药物治疗史，体检无临床意义的阳性体征；④无吸烟史和嗜酒史；⑤试验前3周内，未服药；⑥近1个月内每周饮咖啡或浓茶累积量≤50 g，每日≤10 g；⑦右利手。

1.2.2 排除标准

① 妊娠期及月经期；②抑郁自评量表评分>52分或焦虑自评量表评分>49分者^[10]；③有外伤、皮损等，或所需穴位及其周围皮肤有感染、溃烂者；④存在MRI检查禁忌证者（如幽闭恐惧症、癫痫、颅内动脉瘤、危重症，以及体内植入金属物品等）；⑤试验前3个月内或试验过程中参与其他临床研究者；⑥有晕针或晕血史者；⑦了解试验具体方法和步骤后，不签署知情同意书者。

1.3 剔除与中止标准 1.3.1 剔除标准

① MRI扫描前24 h内饮用含酒精饮品或兴奋性饮料，如咖啡、浓茶者；②MRI扫描前24 h内有明显情绪波动者；③其他病变（如颅脑病变明显或头颅解剖结构严重异常）经fMRI扫描明确者；④数据处理时，头部旋转角度>1°，或向一定方向运动>1 mm者；⑤受试者因各种主观或客观因素无法正常完成试验而中止，主动或被动退出试验者。

1.3.2 中止标准

① 因异常精神状态等而无法完成MRI扫描者；②研究期间发生严重不良事件或危急重症，不宜继续参与本临床试验研究者。

1.4 干预措施

采用Press型一次性采血器、75%酒精消毒液和一次性医用棉签。受试者仰卧位完成静息态fMRI数据采集后，行井穴刺络放血，操作者使用一次性末梢采血针，定位，消毒后，对手十二井穴行刺络放血法操作1次，时间<5 min。

具体方法：先右手后左手，按少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽的顺序进行。手十二井穴的定位参照GB/T12346-2021《经穴名称与定位》。刺络前先从近心端向远心端推压被刺处10次，使被刺处血液充盈。消毒后，操作者用押手固定穴位处，用刺手将采血针快速刺入穴位约1.8 mm，然后退针，轻按针孔附近，使每穴出血2滴（约0.25 mL），再用棉签按压针眼止血。

1.5 临床观察指标 1.5.1 一般生物学指标

年龄、身高、体质量等以及体温、心率、呼吸、血压等（受试者入组后、静息态fMRI扫描前后分别测量1次）。

1.5.2 井穴刺络法促醒的中枢响应特征分析

比较井穴刺络法干预前后受试者大脑局部一致性（Regional homogeneity，ReHo）的变化，将ReHo值发生变化的脑区与脑干ARAS醒觉相关脑区行相关性分析，对比井穴刺络前和刺络后关键脑区在全脑中功能连接网络的变化，探究井穴刺络法介导促醒的中枢网络响应特征。

1.5.3 安全性评价

井穴刺络过程中发生血肿、淤青、晕针等异常情况时，需详细记录刺络时间、异常情况类型、严重程度、处理方式、预后和转归等。

1.6 仪器与方法 1.6.1 扫描仪器及序列参数

采用Siemens 3.0 T MRI扫描仪及64通道相控阵头线圈。扫描序列与参数：①横断面BOLD成像，TR/TE 2 500 ms/30 ms，视野220 mm×220 mm，层数40，层厚3 mm，层距0.3 mm，分辨率96×96，翻转角90°。②矢状面T₁MP-RAGE，层数176，视野250 mm×250 mm，像素大小1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，层厚1 mm，带宽170 Hz/pixel，翻转角9°。③stage成像参数，其中newB1_PDW：TR1/TE1 25 ms/8.5 ms，TR1/TE1 25 ms/18.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，视野256 mm×256 mm，层数64，层厚2 mm，层距2 mm，翻转角24°，带宽240 Hz/pixel。newB2_T₁W：TR1/TE1 25 ms/7.5 ms，TR1/TE1 25 ms/17.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，视野256 mm×256 mm，层数64，层厚2 mm，层距2 mm，翻转角6°，带宽240 Hz/pixel。newB3_MRAV：TR1/TE1 20 ms/2.5 ms，TR1/TE1 20 ms/12.5 ms，像素大小0.7 mm×0.7 mm×2.0 mm，视野256 mm×256 mm，层数64，层厚2 mm，层距2 mm，翻转角12°，带宽1为650 Hz/pixel，带宽2为240 Hz/pixel。④横断面ASL成像，TR/TE 2 500 ms/11 ms，TI1/TI2 2 700 ms/1 800 ms，视野256 mm×256 mm，层厚8 mm，层距2 mm，翻转角90°，矩阵64×64×11。⑤横断面T₂WI，TR/TE 6 000 ms/93 ms，层数25，像素大小0.7 mm×0.7 mm×0.4 mm，视野220 mm×100 mm，带宽220 Hz/pixel，翻转角120°。⑥T₂-FLAIR，TR/TE 8 000 ms/85 ms，层数22，像素大小0.5 mm×0.5 mm×5.0 mm，视野240 mm×240 mm，层厚5 mm，带宽287 Hz/pixel，翻转角90°。

1.6.2 扫描前准备

研究人员需在扫描前详细介绍扫描流程，消除受试者心理压力，使扫描过程顺利进行，以确保采集数据的有效性和试验结果的准确性。

1.6.3 扫描方案

① 记录受试者一般情况（包括文化程度、体质量、身高、性别、姓名、年龄等）。②受试者取仰卧位，佩戴防噪声耳塞，头部置于颅脑线圈内，戴上遮光眼罩，头部两侧填充海绵垫，减少呼吸、心跳引起的头部不自主运动。受试者保持安静、放松、闭眼状态，平静呼吸，保持清醒，行30 min基线静息状态fMRI检查。在正中矢状位图像上平行于前后联合线行定位获得横断面图像，扫描范围覆盖全脑。③完成静息态fMRI数据采集后，用一次性末梢采血针定位、消毒，对指定腧穴行井穴刺络法操作，用计时器计时。④井穴刺络法操作完成后，fMRI数据采集25 min，参数与静息态扫描序列保持一致。

1.6.4 fMRI数据预处理

使用Dicom works软件1.3.5版本，将DICOM格式的原始数据转化为NIFITI格式，使用Matlab平台的SPM12软件进行预处理。步骤：①移除前10个时间点；②层面时间差校正；③头动校正；④空间标准化，将受试者的图像与SPM软件自带的蒙特利尔神经病学研究所提供的模板匹配，并将其脑部图像数据重新采集为3 mm×3 mm×3 mm；⑤去线性漂移；⑥滤噪，提取频率为0.01~0.08 Hz的信号。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0软件，在符合正态分布及满足方差齐性的数据组间比较行t检验；而非参数检验（Mann-Whitney U检验）用于不满足正态分布或方差齐性检验的数据。以上采取双侧检验，统计阈值为P<0.05。

使用SPM12软件包进行ReHo分析，采用肯德尔和谐系数转化ReHo的数值。逐点计算每个体素在同一时间序列中与其相邻的26个体素的ReHo，生成全脑ReHo图。根据全脑模版去除非脑组织，排除模版外的体素。为进行标准化操作，需用全脑的平均ReHo值除以每个体素的ReHo值。用半高全宽为6 mm的平滑核校验产生的ReHo图，以进行空间平滑和滤噪。ReHo结果需使用独立样本t检验或配对t检验，性别为协变量进行统计，统计阈值为P<0.05，采用FWE或FDR校正。

将井穴刺络法前后ReHo值变化的脑区与脑干ARAS醒觉相关脑区（图 1）行相关性分析，筛选出井穴刺络法产生促醒效应的靶向脑区。

使用SPM12软件行功能连接分析。去掉脑脊液和白质信号及头动参数3个协变量；用基于体素的种子点相关全脑功能连接算法，以井穴刺络法发挥促醒效应过程中的关键脑区作为ROI，并以此为种子点，计算出其所有体素的平均时间序列，将其与全脑体素时间序列逐一行Person相关分析，通过Fisher-Z变换将Person相关计算的分布转化为近似正态分布的数据；最终使用配对t检验，以性别为协变量，得到井穴刺络法发挥促醒效应关键脑区的脑功能连接网络变化。统计阈值为P<0.05，以FWE或FDR校正结果。

1.8 质量控制 1.8.1 受试者质量控制

严格执行纳入和排除标准。

1.8.2 针刺操作及效应评价质量控制

行井穴刺络法针刺操作的预试验，穴位位置的选择和针刺操作与正式试验保持一致。井穴刺络法由同一名有中医执业医师资格、熟练操作刺血疗法、经规范化操作培训的硕士研究生完成。

效应评价者的责任是解答受试者在受试过程中产生的疑虑和遇到的问题，不能对受试者的决定产生干扰。

1.8.3 fMRI扫描质量控制

① 设备及磁场的质量控制：MRI扫描均在天津市第一中心医院进行，采用Siemens 3.0 T fMRI扫描仪及标准梯度回波平面成像功能头线圈。由1名培训合格的研究人员实施定位扫描，受试者采用同一序列。②受试者状态的质量控制：除告知受试者MRI扫描注意事项外，针对扫描时的噪音大小、受试者感受及情绪状态等设计评价表，以判断受试者在扫描过程中是否存在过度紧张，或因噪音而产生的烦躁情绪，从而修正数据。③图像分析质量控制：由经验丰富的影像科医师对图像进行筛查，确保无结构异常后，再对采集到的数据进行分析。

1.9 伦理审查

本研究已通过中国注册临床试验伦理审查委员会伦理审批（ChiECRCT20220072）。

1.9.1 收益与风险

① 井穴刺络法已被证实对CNSI临床疗效确切、无毒副反应、安全可靠；②受试者应熟悉包含研究目的、研究方法、治疗方案、影像学检查等与本研究有关的内容；③整个过程不收取受试者任何费用；④研究过程中若出现针刺的不良反应，应及时处理。

1.9.2 受试者的医疗和保护

① 按照《赫尔辛基宣言》的要求制订知情同意书；②详细告知受试者整个研究过程的预期收益，以及由此带来的可能危害和操作上引起的不便；③受试者的个人资料保密，出于自愿原则参加本试验可在本研究中任何时间中止或退出；④受试者如因本研究受到损害，可在合理范围内得到相关补偿；⑤当受试者满足相关要求，并在知情同意书上签名、标注日期后，即为自愿参加本试验，方可入组。

2 预期结果

与基线静息态fMRI扫描数据相比，井穴刺络法后受试者静息态脑功能显著变化，其中脑干ARAS醒觉相关脑区（如丘脑、下丘脑等）脑功能ReHo及脑功能连接网络响应变化显著。

3 讨论

CNSI是成人病死率升高的主要原因之一，但其病理生理学尚未完全阐明^[11]。CNSI性昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素，由昏迷状态恶化为植物状态的患者给社会和家庭带来了沉重的经济负担^[12]。因此，快速及时地采取有效的促醒急救措施是提高CNSI救治率的第一步^[13]。正常意识的保持依赖于ARAS的正常功能及其向双侧丘脑和端脑的投射。CNSI性昏迷发生与ARAS受损或传导功能抑制密切相关，兴奋ARAS神经传导和促进其修复是促醒机制的核心^[14]。目前，仍无特效促醒疗法的根本原因也在于缺乏安全快捷的兴奋和修复脑干ARAS的靶向疗法^[15]。本课题组前期研究发现，井穴刺络法在多种CNSI性昏迷中具有明显的促醒效应，能调节ARAS中腹侧中脑导水管周围灰质、下丘脑结节乳头核区及下丘脑外侧区相关神经元的兴奋性，但这仅从核团局部神经元的功能活动揭示了井穴刺络法的促醒机制，而中枢神经系统对井穴刺络法的整体响应特征尚不明确。考虑到对临床中TBI等CNSI性昏迷患者使用fMRI技术受到安全性、伦理等方面的诸多限制，因此在设计试验时，选择健康人群为试验对象，观察手十二井穴刺络放血疗法干预后所引起的脑功能区信号的变化；并从醒觉相关脑区（包括ARAS）功能活动应答的角度，对井穴刺络法促醒可能的中枢响应特征作初步探索。

本研究采用自身前后对照的设计类型，受试者于MRI检查床上行手十二井穴刺络放血治疗，方便参与，有利于增强其依从性。该方案详细记录刺络前、刺络后的静息态fMRI数据，精确地反映井穴刺络法干预产生的脑功能fMRI及脑功能连接网络响应的瞬时效应和长期效应。基于前期研究发现，井穴刺络法可双向调节中风患者的脑血流量^[16]，增加脑血肿家兔的脑血流量^[17]，故设计该试验同时观察井穴刺络法对脑血流灌注量的变化。本研究可初步探索井穴刺络法的中枢响应特征及观察脑血流灌注变化，有利于进一步丰富现有机制研究内容，揭示井穴刺络法促醒的普适性作用原理，有助于井穴刺络法的实际运用和国际推广，为CNSI性昏迷提供一项新的疗效显著的促醒手段，减轻CNSI性昏迷为家庭带来的经济压力和给社会带来的医疗负担。