龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)作为一种重要的产琼胶红藻^[1-2]，在具有经济价值的同时，还能食用^[3]及作为鲍鱼饵料，并且具有一定的药用价值^[4-5]。它还能吸收N、P元素，修复水体富营养化^[6]，保持生态平衡^[7-9]。

简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)亦称微卫星，属于串联重复序列，以1~6 bp长度为重复单元，重复多次后长度可达几十至几百bp，广泛分布于基因组中^[10]。根据SSR两端的保守序列可设计特异性引物，从而对SSR片段进行扩增。SSR片段的长度会由于重复次数的改变而产生变化^[11]，可以通过电泳来分离及检测。目前SSR研究主要集中在遗传多样性分析、种群结构分析、遗传连锁图谱的构建等方面^[12-15]。

为准确揭示SSR位点的多态性，开发出可利用的分子标记，通常利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)与毛细管电泳来实现最小1~6 bp的多态性片段的分离。本实验以12个野生型龙须菜个体为材料，选择7个SSR位点，分别使用PAGE电泳银染检测和毛细管电泳荧光检测每个位点的多态性信息，并对这2种方法的检测结果进行了比较与检验，旨在探究准确可信的多态性SSR位点的检测方法。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本实验选取12个野生型龙须菜配子体个体作为实验材料，分别采集自青岛雕塑园(36°4′31″N, 120°27′29″E)，青岛湛山湾(36°3′16″N, 120°21′57″E)和威海石岛(36°51′54″N, 122°24′41″E)，每个地点采集4个个体。

藻体经毛笔刷洗后去除表面附着的泥沙与杂藻，在加有Pro培养基的无菌海水中培养。培养温度设置为20 ℃，光照条件为3 500 lux，光暗周期为12 h:12 h。提取基因组DNA前切取藻体新鲜幼嫩部分，使用无菌蒸馏水冲洗几遍后吸干藻段表面水分，待用。

1.2 基因组DNA的提取

用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取龙须菜基因组DNA。0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并利用核酸蛋白质检测仪检测A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀以及DNA浓度。

1.3 SSR引物扩增

SSR位点从龙须菜genome survey的组装序列中获得^[16]，选择7个SSR位点，基于侧翼序列设计引物，具体引物信息见表 1。每对引物退火温度的筛选以12个龙须菜个体的混合样为模板进行PCR扩增。20 μL反应体系中各反应物含量：2.0 μL 10×PCR Buffer，1.5 mmol/L Mg²⁺，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L正向和反向引物，20 ng模板DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件; 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，温度梯度退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存待用。其中退火温度梯度在55~65 ℃设置5个温度值分别为：55.0、56.9、58.7、63.0、65.0 ℃。

3 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，筛选每对SSR引物最合适的退火温度。随后每对引物以12个龙须菜个体为模板，分别进行PCR扩增。反应体系与反应条件与筛选退火温度时相同。

1.4 SSR扩增产物检测 1.4.1 PAGE检测

PCR扩增产物在10 %非变性聚丙烯酰氨凝胶上进行分离。60 W恒功率预电泳30 min，电泳1 h 50 min。电泳结束后将凝胶浸入1g/L AgNO₃染色液中染色20 min；随后转移入去离子水中，漂洗10 s，以去除凝胶表明附着的AgNO₃；再迅速转移到15 g/L NaOH+ 0.3 g/L NaCO₃+ 3 mL/L甲醛显色液中显色15 min左右；最后用蒸馏水缓缓冲洗掉凝胶表面的残余液，置于通风处晾干保存。每一个SSR位点的多态性是根据PAGE胶上不同个体的目的条带之间是否出现明显的分离来判读的。

1.4.2 毛细管电泳检测

将表 1中7对引物合成为FAM标记的荧光引物，其中引物H97再合成1对ROX标记引物，随后进行PCR扩增，PCR反应体系与程序同1.3。利用ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳，得到原始数据后使用软件Gene Mapper 4.0进行分析并生成分型信息和峰图。毛细管电泳分型由上海生工生物有限公司完成。

1.4.3 测序检测

对待检测引物的所有PAGE条带进行切胶回收，具体步骤为：切下目的条带，置于洁净的载玻片上并滴加1~2滴ddH₂O，盖上盖玻片后用力碾碎，将碾碎的胶转移至离心管中，加入25 μL ddH₂O，100 ℃金属浴15 min，13 800 g离心2 min后吸取上清，作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系与程序同1.3。3 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量合格后送测序。测序由华大基因完成。

2 结果 2.1 PAGE检测结果

根据PAGE凝胶上不同个体间差异性条带的判读，得到每一对引物在12个个体中的等位基因数目(见表 2)。经统计，等位基因数目为2个的多态性SSR位点包括三碱基重复的S25、S28和六碱基重复的S96；非多态性SSR位点包括三碱基重复的H30，五碱基重复的H88和六碱基重复的H97、H98。

2.2 毛细管电泳检测结果

毛细管电泳后，各个体泳道内的DNA片段大小可通过与分子量内标的比较而精确获得，如表 2所示，为便于个体间比较，将DNA片段大小四舍五入后保留整数位。引物H30在12个个体中共出现了3种分型结果即137、139和140 bp。已知该SSR位点是三碱基重复序列，因此不同等位基因之间差异3 bp及其倍数，而毛细管电泳结果中却出现了1和2 bp的差异。通过观察峰图发现这种差异可能是目标峰读取不准确造成的。如图 1所示，第10号个体(139 bp)和第11号个体(140 bp)的峰图中都存在两个紧密相连且看起来高度相等的峰，这两个峰分别为一个目标峰和一个怀疑峰，这种情况的产生通常是由于PCR产物浓度偏大，毛细管电泳后检测到的荧光信号强，峰值高度高，峰图上无法完整显示出两峰的高度，而Gene Mapper软件在处理原始荧光数据时会将两峰中实际高度更高的峰认定为目标峰(蓝色实心标注)，这种目标峰的确定方式可能会造成1 bp的分子量差异。第12号个体的峰图未出现上述情况，直接依据峰图读取目标片段的分子量大小为137 bp。因此引物H30最终分型结果为1~11号个体为1种等位基因，分子量大小均为140 bp；第12号个体为第2种等位基因，分子量大小为137 bp。

另外，表 2中引物H88在7号个体上所检测的目标片段分子量(108 bp)与其他个体(106 bp)相差2 bp。由图 2观察到7号个体的目标峰单一，不存在怀疑峰，而以9号个体作为其余个体的代表，其目标峰单一，亦不存在怀疑峰。说明2 bp分子量差异不是由目标峰的选择造成的。又知该位点是五碱基重复序列，等位基因大小应该差异5 bp及其倍数，2 bp不足以构成一个重复单元，也就不足以构成一个新的等位基因，因此7号个体与其余个体具有相同的1种等位基因，即H88位点在12个个体中没有多态性。

根据上述分析方法，排除由目标峰的选择造成的1 bp差异以及非重复单元长度差异的影响后，得到7个SSR位点的毛细管电泳分型结果为：等位基因数目为2个的多态性SSR位点包括三碱基重复的H30和六碱基重复的S96；非多态性SSR位点包括三碱基重复的S25、S28，五碱基重复的H88和六碱基重复的H97、H98。

2.3 两种方法的检测结果比较与测序验证

PAGE与毛细管电泳分型结果相一致的位点包括全部的五碱基和六碱基重复：H88、S96、H97和H98。而分型结果不一致的位点则均为三碱基重复：H30、S25和S28。这3个位点的PAGE结果见图 3：H30位点在所有个体间的条带彼此没有分离开，判读该位点无多态性，但毛细管电泳分型结果为12号个体与其他个体在该位点上相差一个单位长度3 bp；S25位点的7号个体的条带与其他条带分离开，S28位点的2、3、4、5、8号个体的条带与其他条带分离开，均被判读为拥有2个等位基因的多态性位点，但毛细管电泳分型结果均显示12个个体无分子量差异。

针对这3个位点，对每一个个体的PAGE条带进行切胶回收，以回收产物为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行双向测序。测序结果显示：H30位点在12个个体上的SSR序列均为TCTTCTTCTTCT即(TCT)₄，证明故该位点没有多态性，与PAGE判读结果一致；S25位点在7号个体上的SSR序列为(TTC)₃，其余为(TTC)₄，与PAGE结果一致；S28位点在第2、3、4、5、8号个体的SSR序列为(TTC)₅，其余为(TTC)₆，与PAGE结果一致。

经过测序检验，PAGE胶中显示的多态性条带是由重复单元的重复次数的差异造成的，PAGE的分型结果相比于毛细管电泳更加准确可信。

3 讨论 3.1 PAGE电泳检测SSR的方法探究

有研究表明^[17]，在进行SSR检测时，变性胶相比与非变性胶能更清晰地分离杂合子条带，有效减少非特异性条带，获得更好的电泳效果。因此实验初期分别用变性胶和非变性胶进行SSR检测以期比较两者之间的差异，但多次对比后发现电泳效果一致。由于变性胶能使分子质量相差较大的两条DNA链分开导致电泳后产生两条带，从而对分型结果产生误导，再加上制作与操作过程都较之非变性胶复杂，因此本实验采用非变性胶进行电泳。

若想通过PAGE电泳准确、全面的判断SSR位点的多态性，就需要得到清晰且位置准确的条带，从而判断不同个体之间的条带是否具有长度差异，进而统计多态性信息。通过实验过程中对PAGE胶质量、浓度、电压大小、PCR产物上样量等因素的探究，得到以下技术经验：

熟练掌握制胶技术，达到凝胶厚薄一致且质地均匀，以利于电泳分离条带；适当提高胶浓度，同时适当降低电压，以增加凝胶的有效分离范围；优化PCR反应体系与反应条件，筛选合适的退火温度，从而减少非特异性扩增，保证目的条带的扩增效率；适当降低PCR产物上样量，使条带变窄易于分离，或者通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物先进行定量，再根据各自定量结果选择合适的上样量，其目的在于尽量保证所有条带的宽窄一致，利于多态性的正确判定。

3.2 PAGE电泳与毛细管电泳检测SSR方法比较

毛细管电泳在判读目的条带的分子量大小时，有分子内标作为参照，因此十分灵敏。当检测的个体数目很多而且等位变异也很多时，相比PAGE电泳更具有高效性。陈雅琼等^[18]对9份烟草材料的1个SSR位点进行PAGE检测和毛细管电泳检测时，PAGE扩增带型清晰，毛细管电泳检测出两种分子量大小93和113 bp，分子量大小差异为20 bp，这与所挑选引物多态性高有关。在玉米的研究中^[19]，以192份玉米为材料，对7个SSR位点进行两种电泳方法的检测，2种方法检测的结果一致，SSR位点的等位基因数目为4~13。郝晨阳等^[20]对451份北方冬麦的24个SSR位点进行多重毛细管电泳荧光检测和PAGE银染分析，PAGE银染技术检测出每个SSR位点的等位变异数目为3~20，荧光标记技术检测出每个SSR位点的等位变异数目为4~24，在每个SSR位点上荧光标记技术比PAGE银染技术平均多检测到3个等位变异。这些研究结果反映出当等位基因的分子量差异较大，或者等位基因数目较多时，毛细管电泳的准确性很高；尤其在对大量材料进行检测时，毛细管电泳无论在检测准确性还是检测效率上都更理想。但本实验的个体数量少，等位变异少，所检测的SSR位点在不同个体之间最多差异一个重复单元。此时一旦目标峰读取产生误差，就可能会产生长度差异从而造成假阳性的多态性结果，或者漏掉等位变异而造成假阴性结果。因此本实验中相比三碱基重复位点，五、六碱基重复位点的重复单元长度更长，分子量差异更大，能更好的避免误差，毛细管电泳结果就准确。若想要使毛细管电泳中目标峰的读取毫无误差，就需要通过优化PCR扩增体系与反应条件、优化电泳过程、熟练掌握软件操作方法、重复检测等手段来获得理想峰图，准确地识别目标峰并精确地读取目标片段的分子量大小。

另外，毛细管电泳结果中有个别个体荧光峰图缺失，比如8号子代的H88位点，补测后仍然没有峰图，但是该个体的PAGE结果中有目的条带，因此排除无效等位基因的可能性^[21-23]。如果只依靠毛细管电泳结果则无法判断是荧光信号丢失还是无效等位基因。

本实验还进行了2对不同荧光标记(FAM和ROX)的SSR引物的混合检测，即FAM标记的H88和ROX标记的H97的PCR扩增产物(分子量相差50 bp)一起进行电泳，再根据不同的荧光标记分别读取分子量大小。混合检测的结果与单独检测的结果相比较时发现，位点H97在混合检测时分子量大小为160 bp，单独检测时则为156 bp，说明混合检测也需要一定的优化与重复才能保证结果的准确性。

本实验中PAGE电泳结果均通过测序验证了分型的准确性。如果以测序作为一种直接检测SSR位点多态性的手段，需要先进行PCR扩增及电泳检测目的条带：如果是用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，由于琼脂糖凝胶的分辨率低，无法区分差异几个碱基的扩增片段，只能利用电泳结果确定目的条带，然后切胶回收测序，但是当样品数目多，SSR位点数目多时，测序费用不菲且操作繁琐；如果是用PAGE检测目的条带，由于PAGE胶的分辨率高，理论上1个碱基的差异就可以分开，建议直接通过电泳结果读取SSR位点的多态性，除非PAGE电泳结果优化后仍然不足以判定多态性信息，再切胶进行测序检测。

综合上述因素，当样本量少，SSR位点的变异小时，毛细管电泳分型标准的确立与PAGE电泳判读标准的确立相比更加复杂，建议选择PAGE电泳来检测SSR位点的多态性，既能节省较之普通引物昂贵很多的荧光引物的合成费用及试剂、仪器成本，又能保证检测结果的准确性。