2020, Vol. 50
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 兰州理工大学石油化工学院, 甘肃 兰州 730050
活的非可培养状态(Viable but nonculturable state，VBNC)[1]是某些细菌的一种特殊存活形式，指某些细菌在不良环境中形成的一种休眠状态，在常规培养条件下无法繁殖，但仍然保持代谢活性。VBNC状态下细菌的形态、生理生化、遗传特征等都会发生一系列变化，并且在适宜条件下则能够被复苏为可培养状态[2-3]。VBNC状态是中国海洋大学海洋生命学院徐怀恕和美国马里兰大学的著名海洋微生物学家Rita R. Colwell等于1982年研究霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和大肠杆菌(Escherichia coli)在海洋与河口环境的存活规律时首次报道的。该发现在国内外引起了极大的反响，截至2020年3月，已有10 800余篇VBNC相关论文发表。
本文重点介绍VBNC细菌的发现过程、VBNC细菌的主要类群和诱导因素、VBNC细菌的形成机制、生物学特征、检测和复苏方法以及环境VBNC细菌的分离培养等。目前绝大多数海洋微生物尚未获得纯培养，期望通过对VBNC细菌的深入了解，探索海洋细菌培养的新方法，促进海洋微生物新资源的开发利用。
1 VBNC细菌的发现过程1970年代，海洋微生物生态学研究中存在着一些令人困惑的问题，其中包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和其他弧菌的“冬隐夏现”现象。霍乱弧菌是国际上广为关注的病原菌，曾引发六次世界性霍乱病大流行，导致大批患者死亡。当时的研究工作证明，霍乱弧菌是海洋与河口环境中天然微生物区系的成员，可在春夏秋季水温较高时，以常规条件从水体、沉积物和浮游生物中分离培养出来，但在冬季水温降到10 ℃以下时，以上环境中均不能分离培养得到霍乱弧菌，而待第二年水温较高时霍乱弧菌又能再次被分离出来[4]。类似的“年循环”现象同样也存在于副溶血弧菌(V. parahemolyticus)中。当时，这些病原弧菌的“冬隐夏现”现象一直未得到合理的解释，无法确定冬季的弧菌究竟是“死”还是“活”。另外，研究发现海洋环境中并非所有的细菌都能够用人工培养的方法获得纯培养菌株，直接镜检计数法获得的细菌数量往往比常规培养计数法的结果高很多倍[5]，而导致这种现象的原因并不清楚。此外，人们还发现，尽管4 ℃保存是陆生细菌最常用的临时保存手段，但许多海洋细菌在4 ℃中保存一周后就无法继续传代培养，因此海洋细菌的保存一直是海洋微生物学家面临的重要难题。
针对以上科学问题，徐怀恕在美国马里兰大学Rita R. Colwell实验室做访问学者期间，以霍乱弧菌和大肠杆菌为模式菌株，开展了其在海洋与河口环境的存活规律研究[1]。徐怀恕等以美国东海岸中部切萨皮克湾(Chesapeake Bay)的陈化河口水或添加少量蛋白胨的人工海盐溶液作为模拟水体，将霍乱弧菌和大肠杆菌接种到合适的液体培养基中并培养至对数期，收集菌体后接种到灭菌模拟水体(最终含菌量约为1.0×105 cells/mL)中，置于4~6 ℃静置培养。通过定期取样，以总菌计数法和可培养菌计数法检测细菌数量随时间的变化情况。结果显示，尽管细菌总数未见明显变化，但可培养细菌数量却迅速下降，培养约10 d后数量降至零，表明大部分细菌在此时进入了不可培养的状态[1]。
如何证明这些用常规方法不能培养的细菌仍然是活菌？采用的检测方法是发现细菌VBNC状态的关键。徐怀恕等采用了日本科学家Kazuhiro Kogure等[5]当时新建立的活菌直接镜检计数法(Direct viable count, DVC)进行检测，即向水样中加入萘啶酮酸(Nalidixic acid；0.001%，w/v)和酵母膏(Yeast extract; 0.025%, w/v)，37 ℃培养6~24 h后以吖啶橙直接镜检计数法(Acridine orange direct count，AODC)进行计数。萘啶酮酸是DNA促旋酶的抑制剂，能抑制DNA的复制，但不影响RNA的复制和蛋白质的合成，使得处理后的细菌只能生长却无法分裂，而凡是能够合成自身物质并长大的菌体都可被认定为活菌。采用该方法发现模拟水体中的活菌数量一般只降低一个数量级，表明大部分细菌是活菌，但却进入了非可培养状态。基于以上研究，徐怀恕等最终提出了细菌VBNC状态的概念[1]。
VBNC状态是细菌在不利环境中的一种存活机制。当处于不利环境时，细菌无法在培养基上正常地生长并形成菌落，但其细胞仍能够保持完整性，并且维持呼吸作用、基因转录及蛋白质合成等生理过程，只不过其形态、细胞壁的组成会发生一系列改变[1, 6]。
2 VBNC细菌的主要类群及其诱导因素迄今已陆续报道80余种细菌能够在不利环境条件下进入VBNC状态(见表 1)。它们主要是一些微生物学家广泛关注的类群，如人类或养殖生物病原菌、具有重要生态意义的细菌、饮食和发酵工业相关细菌等，其中大多数为革兰氏阴性菌，变形菌门γ-变形菌纲细菌最多(18属48种)，包括约20种弧菌, 少数则属于α-变形菌纲(4属5种)、β-变形菌纲(4属5种)、ε-变形菌纲(3属5种)和拟杆菌门(1属1种)。此外，已发现17种革兰氏阳性菌能够进入VBNC状态，分别属于厚壁菌门(7属11种)和放线菌门(5属6种)。VBNC细菌的种类多样性和广泛分布说明进入VBNC状态是细菌抵抗不良环境的普遍机制。
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表 1 已报道可进入VBNC状态的细菌种类(更新自Oliver[7-8]和Pinto等[9]) Table 1 Bacterial species reported to enter into the VBNC state in different taxa (updated from Oliver[7-8] and Pinto et al[9]) |
目前已知能诱导细菌进入VBNC状态的环境因素包括：高/低温、寡营养、盐度或渗透压、射线、氧气浓度、生物杀伤剂、干燥、pH的剧烈变化及其他环境因子等[2, 6, 9]。这些环境因素可以引起细菌一系列变化，包括细胞形态变化、主要大分子的密度及结构变化及其在固体或液体培养基中生长能力的改变等，这些变化可能最终导致细菌进入VBNC状态[2]。
温度是诱导细菌进入VBNC状态的最重要因素。在对温度变化的反应上，不同种类的细菌，甚至同种细菌的不同菌株，均可能不同。弧菌通常受低温(4~6 ℃)影响明显，而其他细菌(如空肠弯曲杆菌，Campylobacter jejuni)似乎对高温(25~37 ℃)更加敏感[2, 8]。需要注意的是，温度胁迫常伴随有寡营养条件等其他不良环境条件的协同作用。
营养缺乏是诱导细菌进入VBNC状态的另一重要因素。海水中有机物的含量很低，常处于寡营养(1~15 mg C/L)状态。寡营养菌对底物的特异性要求不高，能在寡营养条件下生长，并长时间存活。然而，富营养菌只有在富营养条件下才能生长，进入VBNC状态可增强其在寡营养水体中的存活能力，因此弧菌、假单胞菌(Pseudomonas)等富营养细菌均可在饥饿状态下进入VBNC状态[2, 6]。
盐度或渗透压会对多数肠道菌的生存产生很大的影响，但对海洋或河口的土著细菌影响较小，渗透压保护剂如甘油、甜菜碱、谷氨酸钾和海藻糖等对海水中的大肠杆菌具有保护作用，而对霍乱弧菌的可培养能力没有显著影响[2, 8]。光线对细菌VBNC状态的诱导作用随细菌种类而异，其对细菌可培养能力的影响可能由细胞光化学反应过程中产生的过氧化氢造成[2, 6]。氧胁迫也可诱导细菌进入VBNC状态。如空肠弯曲杆菌暴露在空气中时会很快进入休眠状态，推测可能与其微好氧特性有关。生物杀伤剂如重金属、消毒剂及食品保鲜剂等也可诱导细菌进入VBNC状态[2, 8]。
3 VBNC细菌的诱导机制到目前为止，有关细菌VBNC状态诱导机制的报道仍较少。研究发现，H2O2在诱导许多细菌进入VBNC状态过程中发挥重要作用。创伤弧菌(V. vulnificus)的过氧化氢酶突变菌株更容易进入VBNC状态；而把即将进入VBNC状态的细菌涂布于添加有过氧化氢酶的常规培养基上时，创伤弧菌的可培养性会大大增加，证明H2O2确实可以参与VBNC状态的诱导；低温可抑制过氧化氢酶的合成和活性，使细菌细胞对培养基中的H2O2高度敏感，因此低温培养可使细菌由于冷激反应而进入VBNC状态[2, 8]。
研究发现细菌VBNC状态和饥饿状态是两种不同的应答机制，因为两者的胞内蛋白表达差异较大，但仍有共同之处，如卤化呋喃等小分子物质可能在细胞进入VBNC过程中起到信号传递作用。霍乱弧菌在VBNC状态下有多达100个基因的表达量上升为正常状态的5倍以上，其中包括Fe3+ ABC转运子、PolB、FliG和FlaC等蛋白的编码基因[2, 6]。
此外，研究还发现RpoS、多磷酸盐激酶1(PPK1)和EnvZ三种蛋白质也与细菌进入VBNC状态的诱导机制密切相关。RpoS编码基因的突变能够使大肠杆菌和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)更快地进入VBNC状态，并且大肠杆菌细胞在VBNC状态的维持时间及复苏能力均有所下降；PPK1能够参与多磷酸合成而影响细胞的各种生理功能，在空肠弯曲杆菌中PPK1突变使细菌进入VBNC状态的能力有所下降。EnvZ编码基因的突变也使大肠杆菌无法进入VBNC状态[9]。
4 VBNC细菌的生物学特征除了VBNC状态之外，早期在细菌细胞中发现的其他休眠体形式，主要包括芽孢(Endospore)和孢囊(Cyst)。芽孢是形成于芽孢杆菌属(Bacillus)等少数革兰氏阳性细菌生长后期细胞内的球形或椭球形休眠体，对不良环境具有极强抗逆性[22]，而孢囊是固氮菌属(Azotobacter)等少数革兰氏阴性细菌在营养缺乏条件下由营养细胞外壁加厚并失水缩短而形成的球形休眠体。VBNC细菌与芽孢和孢囊均存在很大差异[6, 9]。
在细胞形态方面，大多数细菌进入VBNC状态后，细胞体积变小，缩成球状，表面积与体积比增加，对营养物质的亲和能力亦随之增加，使它们可以耐受寡营养环境，并可增强对其他环境胁迫因子的抵抗能力，如温度、氧化还原电位、渗透压改变等，但有些处于VBNC状态的革兰氏阳性细菌细胞反而轻微伸长。此外，VBNC细菌的细胞周质间隙变大，细胞表面会出现泡状小突起[2, 8]。
在生理生化特性方面，VBNC细菌对底物的吸收减少，大分子物质合成大幅度下降，细胞质浓缩，营养盐转运及呼吸速率均明显下降，核糖体和染色质密度明显降低，蛋白质和脂类含量下降，但是ATP合成水平较高，细菌质粒也不会丢失。细菌在刚进入VBNC状态时，会合成一些新的蛋白质。在VBNC状态下，细菌对多种胁迫条件的抗性增强。VBNC细菌的细胞膜结构完整但不对称，主要膜脂含量下降，但一些短链和长链脂肪酸含量增加；细胞壁中肽聚糖的交联程度及胞壁肽的O-乙酰化程度增强。细胞壁或细胞膜的改变及新产生的蛋白质可能与VBNC细菌在不良环境下抵抗环境压力有关[2, 9]。VBNC细菌的基因表达水平也与正常细胞不同，如参与转录(RNA聚合酶)、翻译、ATP合成、糖异生代谢(3-磷酸甘油醛脱氢酶)及抗氧化的基因表达水平均有所提高[2, 8]。
在致病性方面，病原微生物进入VBNC状态并不代表它们失去了致病能力。VBNC状态的霍乱弧菌仍能产生霍乱毒素，并导致受测试人员腹泻。然而，并非所有的VBNC病原菌都具有毒性，细菌进入VBNC状态的时间越久，其毒力越低，甚至丧失复苏能力[2, 8-9]。
5 VBNC细菌的检测方法对VBNC细菌的检测通常基于以下方面：细胞的活性或对底物的吸收情况、细胞结构和细胞膜的完整性、DNA和RNA的存在以及蛋白质的合成能力等，然而这些检测方法只能反映细胞活性的某个侧面。有时会出现细胞的活性低于检测阈值，或者不可逆失去繁殖能力的细胞仍然可检测到代谢活性，从而导致检测结果的不准确。唯一可以作为细胞活性检测的充分必要标准是细胞的复苏和生长，但是一些常用培养基和培养条件可能并不适合于细胞的复苏生长，因此不能真实地反映出细胞的活性是否存在[6, 9]。
DVC法是目前最常用的检测方法，由徐怀恕等[1]最初采用，检测原理是基于活性细胞对底物的吸收能力。该方法的基本要点为：在细菌培养物中添加少量的营养物和DNA合成抑制剂——萘啶酮酸，培养6 h后固定，吖啶橙染色，然后用荧光显微镜观察，如果细胞伸长则说明该细菌处于存活状态。
死/活细菌检测试剂盒(Live/Dead BacLight bacterial viability kit)检测法是基于活性细菌细胞膜结构完整性的检测方法[23]。该试剂盒包含两种核酸染料，即SYTO 9和碘化丙啶(Propidium iodide，PI)。SYTO 9在480/500 nm波长下呈现绿色，且死/活细胞均能被染色；碘化丙啶由于不能进入具有完整细胞膜结构的细菌，而只能染色“死”细胞，且会减弱SYTO 9造成的绿色荧光效果，使其在490/635 nm波长下呈现红色，因此死、活细胞在荧光显微镜下分别显示红色和绿色。
分子生物学检测手段是目前的发展趋势，但由于VBNC细菌的DNA和RNA含量减少，采用PCR等手段检测VBNC细菌时，需要大大增加模板量。以DNA为基础的检测手段无法区分死活细胞，可导致假阳性结果的出现。另一方面，由于mRNA在细胞代谢中具有短暂的半衰期(3~5 min)，是细胞存活的一个良好标志，因此可以利用逆转录PCR手段检测基因表达情况，从而确定不能被培养的细菌是否仍然能够进行基因转录[24]。
6 VBNC细菌的复苏方法由于VBNC应答是细菌的一种存活机制，VBNC细菌的复苏是必要的，目前有关VBNC细菌在自然环境中如何复苏为可培养状态的过程尚不完全清楚。尽管已发现80余种VBNC细菌，但目前已报道能够复苏的细菌种类只有10余种，并且其复苏刺激因子也各不相同[9]。
直接逆转不利条件可使某些VBNC细菌复苏[3]，采用的方法包括提高培养温度、在培养基中添加某些营养盐、对因盐度胁迫进入VBNC状态的某些细菌添加渗透压保护剂等。大部分细菌从VBNC状态复苏的时间为10天到3个月[9]。Ayrapetyan等[25]发现，加入密度感应自诱导分子AI-2能够诱导进入VBNC状态的创伤弧菌复苏。过氧化氢分解剂、丙酮酸钠、多种氨基酸、富营养培养基等对VBNC细菌的复苏也有促进作用[9]。最近有研究发现，密度感应系统能够通过激活鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)过氧化氢酶的表达而使其从VBNC状态复苏[26-27]。
在海水环境中，有些VBNC细菌的复苏可能是通过鱼类及无脊椎动物(特别是一些桡足类等浮游动物)实现的。有研究者将自由生活的卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)添加到VBNC细菌中，从而使嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)复苏为可培养状态，说明原生动物对VBNC细菌的复苏发挥重要作用[2, 8]。此外，将VBNC细菌接种于宿主体内，也可使其复苏。许兵等[28]通过在实验兔肠结扎段中注射VBNC状态霍乱弧菌，使兔肠结扎段严重积水肿胀并导致实验兔死亡，之后采用DVC法和TCBS平板培养法，均可从实验兔肠积液中检测到有活性的霍乱弧菌，且复苏后的霍乱弧菌仍具有毒性。此外，也有研究表明霍乱弧菌O1减毒株的VBNC状态细菌也可在人体内复苏，并保留毒性。Du等[12]将处于VBNC状态的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)接种到鸡胚卵黄囊中，接种后第6天从鸡胚内分离出了迟缓爱德华氏菌。此外，添加营养物质并升温至25 ℃培养8 d后，也可使VBNC状态的迟缓爱德华氏菌复苏，复苏后的迟缓爱德华氏菌仍然对大菱鲆具有致病性。
复苏促进因子(Resuscitation-promoting factor，Rpf)最初发现于藤黄微球菌中，可促进休眠菌的复苏生长。Rpf广泛存在于厚壁菌门的革兰氏阳性细菌中。Rpf蛋白属于水解转糖基酶(Transglycosylase)家族，与溶菌酶的功能相似，可以水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的糖苷键，在肽聚糖合成等过程中发挥重要作用。有的革兰氏阳性细菌中含有的rpf基因可高达5个[6, 9]。在革兰氏阴性细菌中也发现了功能类似于Rpf的蛋白质，如沙门氏菌属、弧菌属(副溶血弧菌、哈维氏弧菌等)的复苏促进因子YeaZ，能够促进VBNC细菌的复苏，但其结构与革兰氏阳性菌的Rpf有明显差别，YeaZ的功能更类似于糖蛋白酶(Glycoprotease)[9, 29]。
7 环境VBNC细菌的分离培养自然环境中存在大量的VBNC状态的或难培养的微生物，这些微生物在活性物质生产、环境保护等领域有着巨大的应用潜力。为了提高这些微生物的分离效果，可添加促进微生物细胞复苏的化学物质或改善微生物的培养条件等。
许多学者发现，添加藤黄微球菌的Rpf蛋白能够促进环境中细菌的复苏和生长；通过该方法分离到的细菌类群包括分枝杆菌属(Mycobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和Curvibacter fontanus等[30-32]。李鸿炫[33]发现藤黄微球菌重组Rpf蛋白能够促进嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivoran)的生长，并促进该菌对土壤中多氯联苯的降解，添加Rpf后土壤可培养细菌总数显著增加，各菌群丰度和多样性也发生变化。高学宇[34]发现在印染废水中添加Rpf蛋白后，新分离的沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)具有苯胺降解作用。Su等[35-36]发现添加藤黄微球菌Rpf蛋白能够促进农业和厨余废弃物堆肥中纤维素降解菌的分离，包括分属于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的博德特氏菌(Bordetella)、潘多拉菌(Pandoraea)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardiopsis)和分支杆菌属(Mycobacterium)等。研究者从能够降解石油的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)中克隆的重组Rpf蛋白不仅能促进VBNC细胞复苏，还能促进正常细胞的生长[37]，将该重组蛋白添加到环境土壤样品中，能有效提高土壤样品中微生物的分离效果。此外，Mu等[38]利用富集培养方法使近海沉积物中的VBNC细菌得到复苏，并分离鉴定出大量的海洋细菌新分类单元。
8 总结与展望细菌VBNC状态概念的提出，揭示了自然界中细菌的一种抵御不良环境条件的新的休眠体形式，解开了100多年来存在于流行病学研究中的霍乱弧菌“冬隐夏现”之谜，合理地阐明了该菌通过VBNC状态进行越冬的机制。VBNC细菌的发现对传统的微生物生态学、食品安全、水质监测、公众健康及流行病学研究等均提出了新的挑战，也为人们评估基因工程菌的危险性提供了新的依据。细菌VBNC状态的研究，对微生物种质资源的有效保存也具有重要意义。因为许多海洋细菌在4 ℃条件下保存一段时间之后，会进入VBNC状态，因此4 ℃可能更适合常规陆生细菌的保存，而海洋细菌更适宜于16 ℃左右或更高温度保存。
传统微生物学培养方法只能获得环境样品中实际微生物数量的不到1%，VBNC细菌的发现很好地解释了这一现象。海洋环境复杂多变，营养、高压、pH或盐度等环境因子的剧烈变化都可能引起细菌的一系列改变，这些改变涉及细胞形态、主要大分子密度及结构，以及细菌在常规培养基中生长能力等，最终导致细菌进入VBNC的休眠状态，得以渡过难关存活下来。通过对VBNC状态细菌及其复苏机制的深入研究，可以对海洋细菌的培养方法进行探索创新，有助于进一步开发利用丰富的海洋微生物资源。目前已有研究证明复苏因子的添加可以促进对海洋环境中未培养微生物的分离培养, 该研究方向有望成为该领域的新研究热点。
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