2024, Vol. 54
褐藻是海洋大型藻类中规模最大、形态最复杂的一类，褐藻胶(Alginate)是褐藻的基本碳水化合物成分[1]。褐藻纲中，尤其是在曾藻目和岩藻目中, 一些海藻所含的褐藻胶量特别大，约占其干质量的55%[2]。褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate，M)以及α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronate，G)构成，这2种差向异构体可以形成3种不同的嵌段(多聚甘露糖醛酸片段(polyM)、多聚古罗糖醛酸片段(polyG)以及交替杂合片段(polyMG))[3]。褐藻胶具有优异的凝胶性、稳定性以及增稠性，在食品、纺织、医药等领域有着广泛的应用[4]。但是褐藻胶分子量大，难以被机体吸收利用，限制了其应用的广泛程度。由于褐藻胶制备形成的褐藻寡糖(Alginate oligosaccharides，AOS)具有比褐藻胶分子量小、水溶性高以及黏度低的优势，因此褐藻寡糖的应用范围更广[5]。褐藻寡糖具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗高血压、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节以及促进植物生长等活性[6-8]。
研究表明，同物理法以及化学法相比，酶解法(所用的酶主要是褐藻胶裂解酶)制备褐藻寡糖具有作用条件温和、产率高的优势，在褐藻寡糖产业化制备中具有重要的应用前景[9]。褐藻胶裂解酶(Alginate lyases)属于多糖裂解酶家族(Polysaccharide lyases family，PL)，主要是通过β-消除反应降解褐藻胶[10]。在碳水化合物酶的数据库中(http://www.cazy.org/)，根据一级序列，已发现的褐藻胶裂解酶被分成14个褐藻胶裂解酶家族，分别是PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39以及PL41[11]。越来越多的褐藻胶裂解酶被表征，但由于以往的褐藻胶裂解酶存在纯化繁琐、稳定性差以及酶活力低等问题，导致其极少应用于生产制备褐藻寡糖[12]。因此，仍需要不断开发挖掘新型的褐藻胶裂解酶，应用于褐藻寡糖的大规模制备[13-14]。
本文从颊吻鼻鱼肠道酶筛选到一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp. 01，从中克隆了一个PL7家族的褐藻胶裂解酶，该酶是双功能的内切酶，能够有效降解各种形式的褐藻胶，产生聚合度(Degrees of polymerization，DPs)为2~4的褐藻寡糖。酶学性质表明，该酶能够在适中的反应温度以及较宽的pH范围发挥作用，具有开发成为工具酶的潜能。
1 仪器，材料与方法 1.1 菌株、试剂与仪器菌株：E. coli BL21(DE3)、质粒pET32a-p以及Prescission蛋白酶均由本实验室制备并保存；Pseudoalteromonas sp. 01是从颊吻鼻鱼肠道微生物中获得，并由实验室保存。
试剂：褐藻胶购自上海源叶生物有限公司；通过酸解法制备而获得polyM和polyG[15]；Ni-NTA琼脂糖凝胶购自于康为世纪生物科技有限公司；所使用的限制性内切酶是BamH Ⅰ和Xho Ⅰ，所使用的T4 DNA连接酶以及PrimerSTAR® HS DNA聚合酶均购自于Omega Bio-Tek公司；其他化学试剂均购自于国药集团。
仪器：T100 PCR仪(供应商：美国Bio-RAD)；电泳仪(供应商：北京六一仪器厂)；垂直蛋白电泳装置(供应商：美国BIO-RAD)；细胞超声破碎仪(供应商：宁波新芝生物科技有限公司)；酶标仪(供应商：美国Bio-Tek)。
1.2 实验方法 1.2.1 AlyPC1序列分析基于微生物培养法，从颊吻鼻鱼肠道微生物中筛选到一株高效降解褐藻胶的菌株Pseudoalteromonas sp. 01，推测其基因组中含有降解褐藻胶的相关酶系。对其基因组进行测序，从注释的信息中获得了一个褐藻胶裂解酶的基因，将该酶命名为AlyPC1。
首先，使用在线软件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测AlyPC1的信号肽，使用在线软件SMART(http://smart.embl.de)[16]预测分析AlyPC1的结构域, 利用MEGA 7.0中最大拟然法, 将AlyPC1的氨基酸序列同PL7家族各成员的氨基酸序列进行比对分析，构建系统发育树。利用Bioedit软件对AlyPC1和同亚家族的序列进行多序列比对，然后利用在线软件ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)对多序列比对结果进行分析。通过在线软件Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)预测AlyPC1的分子量。
1.2.2 AlyPC1原核表达载体的构建以Pseudoalteromonas sp. 01基因组DNA为模板，设计PCR正向引物PC1-F(CGCGGATCCTGTGGCTCATCATCACCAACTAATG)和反向引物PC1-R(CCGCTCG-AGTTAATTATGTGAAGTAAATAAGCGATAG)，获得了不含信号肽的alypc1片段。引物PC1-F和PC1-R分别含有BamHⅠ的酶切位点和 XhoⅠ的酶切位点，利用限制性内切酶BamHⅠ和 XhoⅠ将PCR片段酶切；同时利用上述限制性内切酶将质粒pET32a-p线性化。将酶切片段与质粒pET32a-p通过T4 DNA连接酶连接；连接产物转化入E.coli BL21(DE3)中，获得的阳性克隆，送至上海生工生物有限公司进行测序，并将其中测序正确的克隆被命名为pET32a-AlyPC1。
将保存的甘油菌pET32a-AlyPC1按照1%的比例接种于含有氨苄霉素(Amp)抗性的50 mL溶菌肉汤(LB)液体培养基中，在37 ℃条件下180 r/min摇床培养12 h；活化的菌株按照1%的接种量接种于含有1 L LB液体培养基的锥形瓶中，培养基中加入Amp，在37 ℃条件下培养，待OD600值在0.6~0.8之间时，向培养基中加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16 ℃ 180 r/min培养20 h。
培养结束后收集菌体，然后使用15 mL的缓冲液(Tris-HCl(pH=7.5)20 mmol/L、NaCl 500 mmol/L和咪唑10 mmol/L)重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体(程序为超声2 s后暂停4 s，总循环时间为25 min)；超声破碎结束后，12 000g离心30 min，收集上清液。上清液通过镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，用蛋白酶酶切，以除去融合蛋白中硫氧还蛋白(TRX)标签，获得目的蛋白AlyPC1。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析蛋白纯度，使用酶标仪检测OD280值，测定蛋白浓度。
1.2.3 酶活力性测定将褐藻胶底物溶解于含Tris-HCl(pH=8.0)20 mmol/L + NaCl 200 mmol/L的缓冲液中，配制成浓度为2 mg/mL褐藻胶溶液。反应体系有200 μL，其中包括190 μL底物溶液(2 mg/mL)以及10 μL 0.06 mg/mL的AlyPC1，在35 ℃条件下反应5 min，反应结束后在100 ℃灭活10 min。由于降解产生的褐藻寡糖含有不饱和双键，在波长235 nm处有高吸收值，因此，取200 μL反应产物检测OD235值。以190 μL褐藻胶以及10 μL的缓冲液(Tris-HCl(pH=8.0)20 mmol/L + NaCl 200 mmol/L)的反应作为对照组。酶活力单位(U)定义为每分钟OD235增加1为1 U[17]。
1.2.4 AlyPC1酶学性质表征为确定AlyPC1的最适反应温度，在5~60 ℃下进行酶活测定；为测定热稳定性，将酶在5~60 ℃条件下孵育1 h后，测定其剩余活性。为了研究AlyPC1的最适反应pH，将底物溶解于浓度为20 mmol/L的不同pH的缓冲液中，其中缓冲液有CH3COONa溶液(pH在5.0~6.0之间)、Na2HPO4-NaH2PO4溶液(pH在6.0~7.5之间)、Tris-HCl溶液(pH在7.5~9.0之间)和Gly-NaOH溶液(pH在9.0~11.0之间)4种，并在最适反应温度下测定酶活。为了确定NaCl含量对AlyPC1酶活性的影响，向反应底物中添加不同比例的NaCl，NaCl含量梯度设定为0、50、100、200、300、400、500和600 mmol/L。为测定不同金属离子和EDTA对AlyPC1的影响，将反应体系分成10组，每组中分别添加1 mmol/L的K+、Na+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+和EDTA，以不添加任何金属离子测定的酶活性为对照，测定AlyPC1的酶活。为测定底物专一性，将褐藻胶、polyG和polyM作为底物，分别溶解于三个20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)+200 mmol/L NaCl缓冲液中，在最适反应条件下测定酶的底物专一性。
1.2.5 AlyPC1对褐藻胶的降解过程将2 mg/mL褐藻胶溶解于20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)+200 mmol/L NaCl缓冲液中，取100 μL褐藻胶同3 U的AlyPC1反应，分别在降解0、1、5、10、20、30和60 min时取样，最后利用薄层色谱(Thin layer chromatography，TLC)分析不同降解时间下褐藻胶降解的产物分布。
2 实验结果 2.1 AlyPC1序列分析从Pseudoalteromonas sp. 01中克隆出一种褐藻胶裂解酶基因alypc1，GeneBank收录号为ON112080。该酶的cDNA共计1 737 bp, 编码578个氨基酸残基，去掉信号肽后，AlyPC1的理论分子量为61 kDa。经在线软件SignalP 5.0预测出AlyPC1的前22个氨基酸残基(Met1-Gly22)为信号肽。如图 1所示，AlyPC1是一个多结构域褐藻胶裂解酶，有2个非催化结构域以及一个催化结构域构成，其中2个非催化结构域分别为CBM32和CBM6。系统发育树(见图 2A)表明，AlyPC1属于PL7家族第5亚家族。同时，多序列比对(见图 2B)表明，AlyPC1的催化结构域AlyPCCD的氨基酸序列同来源于Microbulbifer sp. 6532A的AlyMsp[18]的氨基酸序列相似性最高，约为65.2%。
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图 1 AlyPC1结构域示意图 Fig. 1 Schematic diagram of modular organization |
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( A：AlyPC1系统进化树；B：AlyPC1的催化结构域AlyPCCD与PL7褐藻胶裂解酶一级序列比对。图B中所有序列的来源信息同图A中的一致。A: The phylogenetic tree of AlyPC1; B: Multiple amino acid sequence alignment of AlyPC1 and other alginate lyases of PL7 sub.5. The source information for all sequences in Figure B is consistent with that in Figure A. ) 图 2 AlyPC1序列分析 Fig. 2 The sequence analysis of AlyPC1 |
将克隆的alypc1片段与pET32a-p载体质粒连接后转化至E. coli BL21(DE3)中，融合蛋白在16 ℃诱导表达20 h。如图 3第2、3泳道所示，融合蛋白AlyPC1能够正确表达，且为可溶性蛋白。SDS-PAGE电泳结果如图 3第4泳道所示，可通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化并用Prescission蛋白酶酶切后可以获得纯度较高的AlyPC1，分子量为61 kDa，同预测分子量相近。经计算，1 L菌体培养液可获得20 mg纯化蛋白。
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( M：蛋白标准品；1：未诱导菌体；2：IPTG诱导后菌体；3：菌体超声破碎后上清液；4：经纯化-蛋白酶酶切后的目的蛋白AlyPC1。M: Protein marker; 1: The bacterium before induction; 2: The bacterium after induction by IPTG; 3. The supernatant after sonication; 4. The protein AlyPC1 after purification and Prescission digestion. ) 图 3 AlyPC1的SDS-PAGE电泳检测结果 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of AlyPC1 |
如图 4A所示: AlyPC1最适反应温度为35 ℃，在5 ℃时其酶活性仅为其最高酶活性的60%；高于40 ℃时其酶活性迅速下降；在60 ℃时其酶活性仅为其最高活性的20%。将AlyPC1置于5~60 ℃孵育1 h，通过测定剩余活性验证AlyPC1的稳定性(见图 4B)，AlyPC1在低于30 ℃条件下孵育后，酶活性保留了约80%，但是随温度升高，孵育后剩余活性降低，在40 ℃孵育后活性仅剩30%左右。如图 4C所示，AlyPC1最适反应pH为8.0，且pH在7.5~9.0之间时其酶活性保留90%以上。综上所述，AlyPC1在适中温度以及较为宽泛的pH范围内发挥作用，具有开发成为工具酶的潜能。
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( A：温度对AlyPC1活性的影响；B：AlyPC1温度稳定性；C：pH对AlyPC1活性的影响；D：NaCl浓度对AlyPC1活性的影响；E：金属离子对AlyPC1活性的影响；F：AlyPC1底物特异性。A: The effect of temperature on the enzymatic activity of AlyPC1; B: The thermal stability of AlyPC1; C: The effect of pH on the enzymatic activity AlyPC1; D: The effect of NaCl concentration on the activity of AlyPC1; E: Effects of metal ions on the activity of AlyPC1; F: Substrate specificity of AlyPC1. ) 图 4 AlyPC1的酶学性质 Fig. 4 Characterization of AlyPC1 |
NaCl含量对AlyPC1活性的影响如图 4D所示，反应体系含有NaCl 200 mmol/L时的酶活最高；反应体系中不添加NaCl时的酶活性仅为反应体系中含有NaCl 200 mmol/L时的酶活性的60%。同时，本研究中测定了不同金属离子对于AlyPCL酶活性的影响(见图 4E)，K+、Na+、Ca2+和Mg2+对于AlyPC1的酶活性有轻微的促进作用。相反，Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+以及EDTA能够明显抑制AlyPC1的酶活性。
此外，如图 4F所示，AlyPC1能够有效地降解褐藻胶、polyG以及polyM三种底物，比活力分别为425.4、298.6和152.5 U/mg，表明AlyPC1为双功能褐藻胶裂解酶[8]。
2.4 AlyPC1对褐藻胶的降解过程AlyPCl降解褐藻胶如图 5所示：前30 min内，AlyPCl随机切断褐藻胶，从而产生聚合度较高的褐藻寡糖，此时产生的寡糖以四糖为主，表明AlyPC1是一个内切型褐藻胶裂解酶；30 min后，小分子量的褐藻寡糖降解后的主要产物为三糖，最终的反应产物中含有二糖、三糖以及四糖。
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图 5 TLC检测AlyPC1降解褐藻胶随时间变化的产物 Fig. 5 Time-course of alginate degradation by AlyPC1 was analyzed by TLC |
AlyPC1最适反应温度为35 ℃，在低于30 ℃条件下可以稳定存在1 h，说明AlyPC1在较为适中的温度下发挥作用。PL6家族的TsAly6A最适反应温度为35 ℃，但是在10和20 ℃下的酶活性分别是最大活性的21.1%和73.1%[19]；而相同条件下，AlyPC1的酶活性分别是最高活性的64.4%和82.2%，这说明AlyPC1在室温下更具有优势，有利于降低制备寡糖的成本。另外，来自于同家族的rPyAly[20]和AlyD[21]最适反应pH均为8.0，但是在pH=7.5以及pH=9.0时，rPyAly[20]和AlyD[21]的酶活性分别是其最大活性的80%和60%[21]；而相同反应条件下，AlyPC1能够保留其最高活性的90%以上，表明AlyPC1能够在较为宽泛的pH范围内发挥作用，降低了反应过程对缓冲液pH的需求。
AlyPC1可以降解褐藻胶、polyG以及polyM，但降解效率不同，证明AlyPC1是一个有偏好性的双功能的褐藻胶裂解酶。各种形式的褐藻胶均可作为AlyPC1的底物，说明AlyPC1可以充分利用资源。
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