武汉大学学报(医学版)   2018, Vol. 39Issue (5): 765-768   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.7001.
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引用本文 

李光, 吕丽琼, 周晨亮, 夏文芳, 张迪. 高碳酸血症对机械牵张肺泡上皮细胞的保护作用机制[J]. 武汉大学学报(医学版), 2018, 39(5): 765-768. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.7001.
LI Guang, LÜ Liqiong, ZHOU Chenliang, XIA Wenfang, ZHANG Di. Protective Effects of Hypercapnia on Alveolar Epithelial Cells Injury Caused by Mechanical Stretch[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2018, 39(5): 765-768. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.7001.

作者简介

李光，男，1982-，医学博士，副主任医师，主要从事ARDS、呼吸机相关性肺损伤方面的研究, E-mail: 9620594@qq.com

基金项目

湖北省自然科学基金青年面上项目(编号：2017CFB389)

文章历史

收稿日期：2017-03-11
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
高碳酸血症对机械牵张肺泡上皮细胞的保护作用机制
李光 1, 吕丽琼 2, 周晨亮 1, 夏文芳 1, 张迪 1     
1. 武汉大学人民医院 重症医学科 湖北 武汉 430060;
2. 武汉大学人民医院 血管外科 湖北 武汉 430060
收稿日期：2017-03-11
基金项目：湖北省自然科学基金青年面上项目(编号：2017CFB389)
作者简介：李光，男，1982-，医学博士，副主任医师，主要从事ARDS、呼吸机相关性肺损伤方面的研究, E-mail: 9620594@qq.com
[摘要] 目的: 研究高碳酸血症对机械牵张下肺泡上皮细胞的影响及机制。方法: 采用随机数字法，将体外肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞分为4组：静止对照组(A组)，机械牵张组(B组)，机械牵张+正常二氧化碳孵育组(C组)，机械牵张+高二氧化碳孵育组(D组)。采用机械牵张装置分别给予B、C、D组20%的应力牵张细胞，频率0.5 Hz，加载时间为24 h。其中C组和D组分别在正常二氧化碳环境(5% CO2)和高二氧化碳环境下(15% CO2)孵育，牵张时间共24 h，选择不同时间点(0，6，12，24 h)取细胞上清测定炎性因子肿瘤坏死因子(TNF-α)，白细胞介素-8(IL-8)的表达；实验结束后，Western Blot测定血管生成素-2(Ang-2)蛋白的表达，MTT比色法检测细胞活力，非放射性细胞毒性试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放率。结果: 同对照组比较，随时间延长，机械牵张(B组)可引起A549细胞炎性因子TNF-α和IL-8水平升高(P＜0.05)，Ang-2蛋白表达增加，细胞活力降低，LDH释放增加(P＜0.05)。同B组比较，D组A549细胞炎性因子TNF-α和IL-8水平下降(P＜0.05)，Ang-2蛋白表达下调，细胞活力增加和LDH释放减轻(P均 < 0.05)。结论: 高碳酸环境可减轻机械牵张造成的细胞损伤，下调炎性因子水平，其机制可能通过下调Ang-2蛋白表达相关。
关键词：高碳酸血症    呼吸机相关性肺损伤    肺泡上皮细胞    血管生成素-2    
Protective Effects of Hypercapnia on Alveolar Epithelial Cells Injury Caused by Mechanical Stretch
LI Guang1, LÜ Liqiong2, ZHOU Chenliang1, XIA Wenfang1, ZHANG Di1     
1. Dept. of Critical Care Medicine, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;
2. Dept. of Vascular Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
[Abstract] Objective: To investigate the effect and protective mechanism of hypercapnia on alveolar epithelial cells caused by mechanical stretch. Methods: Type Ⅱ alveolar epithelial cell line A549 cells were divided into four group by using the method of random numbers: silence control group (group A), mechanical stretch group (group B), mechanical stretch + normal CO2 group (group C), and mechanical stretch + hypercapnia group (group D). Cells in B, C, D groups were exposed to 20% strains at the frequency of 0.5 Hz for 24 h under mechanical stretch device. The group C and group D were incubated for 24 hours in the normal environment of carbon dioxide (5% CO2) and high carbon dioxide environment (15% CO2) respectively. Cell supernatant were extract at different time points (0, 6, 12, 24 hours) to examine the inflammatory factor TNF-α and IL-8 expression; Western Blot method was adopted to examine the expression of Ang-2 protein, the cell viability was measured by MTT assay. Non-Radioactive Cytotoxicity Assay method was used to test LDH released. Results: Mechanical stretch (B group) can significantly increase A549 cell inflammatory factors TNF-α and IL-8 expression, and Ang-2 protein expression increased, cell viability decreased and LDH released increased. Compared with that respectively in B group, TNF-α and IL-8 expression decreased (P < 0.05), Ang-2 protein expression increased and LDH released more, cell viability was enhanced (P < 0.05). Conclusion: Hypercapnia can reduce the cell damage which caused by mechanical stretch, and down regulate the level of inflammatory factors, which may be related to the reduction of Ang-2 level.
Key words: Hypercapnia    Ventilator Induced Lung Injury    Alveolar Epithelial Cells    Angiopoietin-2    

机械通气是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的主要治疗手段，机械通气改善机体氧合时，其反复牵张肺泡可导致呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury, VILI)，增加ARDS患者的病死率[1]。而采取减小潮气量和适当提高呼气末正压(positive end-expiratory pressure, PEEP)水平的肺保护通气策略可提高ARDS患者的生存率，但这些措施易致动脉血二氧化碳分压(PaCO2)升高，导致的高碳酸血症(hypercapnia, HPC)以往被认为对机体不利而当作肺保护通气策略的副作用。但近年来研究发现机体对HPC有一定的耐受和容许性，其本身可对多个器官产生保护效应[2]，但缺乏研究证实其病理生理机制。

血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)与肺血管渗漏性水肿及ARDS的严重程度相关，ARDS死亡患者血中Ang-2水平明显升高[3]。本研究拟通过应变加载系统对肺泡上皮细胞进行诱导培养，研究在高二氧化碳环境下机械牵张对肺泡上皮细胞炎性因子及Ang-2表达的影响，探讨允许性高碳酸血症在VILI中的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料

肺泡Ⅱ型上皮细胞株(A549细胞)购自华中科技大学同济医学院细胞免疫实验室，DMEM-12培养液(Hyclone，美国)，胎牛血清(Sciencell，美国)，细胞柔性基底加载装置Flexercell-4000TTM(Flexcell，美国)，二氧化碳孵箱，MTT试剂盒(Sigma，美国)，TNF-α，IL-8 ELISA试剂盒(KOMA，韩国)，Ang-2抗体(Zymed，美国)。CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒(Sigma，美国)。

1.2 细胞培养

A549细胞培养于含10%胎牛血清DMEM-12培养液，培养液中含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素，于恒温恒湿CO2孵育箱培养，温度37 ℃，CO2含量5%。将A549细胞以0.5×106/孔接种于包被胶原基底膜collagenⅠ的BioFlex 6孔培养板，孵育过夜。细胞贴壁并融合50%后，用无血清DMEM-12培养基洗3遍，并换成无血清DMEM-12培养基2 ml。

1.3 细胞牵张模型建立及实验分组

将培养的A549细胞的BioFlex6孔板置于FX- 5000T应变加载系统上，选择25 mm牵张平台，频率调整为0.5 Hz，牵张与放松时间之比为1:1，给予应变力20%的机械牵张。采用随机数字法，将培养细胞分为4组(n=24)：静止对照组(A组):常规培养，不行机械牵张；机械牵张组(B组)：给予20%应力牵张24 h；机械牵张+正常二氧化碳孵育组(C组)：5% CO2环境下给予20%应力牵张24 h；机械牵张+高二氧化碳孵育组(D组)：15% CO2环境下给予20%应力牵张24 h。

1.4 细胞因子TNF-α及IL-8检测

分别于机械牵张开始，6，12，24 h，每组取6孔，留取上清液，3 000 r/min离心5 min，-20 ℃冰箱保存待测。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养基上清液中TNF-α，IL-8含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.5 Western Blot检测Ang-2蛋白表达

蛋白裂解液提取蛋白，取50 μg蛋白质行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转印到硝酸纤维膜上。将膜放入含50 g/L脱脂奶粉的PBST中封闭，4 ℃过夜后，用PBST洗膜3次，每次10 min；然后加入一抗[Ang-2(1:500)；β-actin(1:1 000)]37 ℃孵育2 h；除去一抗，用PBST洗膜3次，每次10 min，然后加入与一抗相应的二抗(1:2 000)，37 ℃孵育2 h，用PBST洗膜3次, 采用ECL显色液显色并照相。

1.6 细胞活力检测

将细胞以0.3×105个/孔接种于96孔培养板中，每组取6孔，细胞培养结束后每孔加入甲基噻唑蓝20 μl(5 mg/m1)，37 ℃孵育4 h，弃上清，加入150 μl二甲基亚砜，置于摇床上10 min，应用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度值，以此反映细胞活力。

1.7 细胞损伤检测

通过非放射性细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率，细胞接种后，收集上清液，加入细胞裂解液，震荡，按照试剂盒说明书测定上清液和细胞裂解液中LDH活性。LDH释放率=上清液LDH活性/(上清液LDH活性+细胞裂解液LDH活性)×100%。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 高碳酸环境下机械牵张对肺泡上皮细胞炎性因子TNF-α及IL-8的影响

与静止对照组(A组)相比，给予20%机械应力牵张的A549细胞时间依赖性的增加了炎性因子TNF-α和IL-8的释放(P＜0.05)。同C组相比，D组可降低炎性因子的表达水平，且差异具有统计学意义，见表 1。

表 1 ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平
2.2 高碳酸环境对机械牵张肺泡上皮细胞细胞活力和LDH释放的影响

图 1结果显示，与A组相比，给予20%机械应力牵张24 h的A549细胞存活率由(96.3±2.3)%下降至(38.1±3.6)%(P＜0.05)，而在高二氧化碳环境下(D组)，细胞存活率则升至(86.6±4.2)%(P＜0.05)。图 2结果显示，同静止对照组比较，机械牵张对肺泡上皮细胞具有明显损伤作用，LDH释放显著增多(P＜0.05)，而在高二氧化碳环境下可使LDH的释放作用明显减弱，与机械牵张组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图 1 高碳酸环境对机械牵张肺泡上皮细胞细胞存活力的影响 *P＜0.05，与A组比较；#P＜0.05，与B组比较，n=24
图 2 高碳酸环境对机械牵张肺泡上皮细胞LDH释放的影响 *P＜0.05，与A组比较；#P＜0.05，与B组比较，n=24
2.3 机械牵张对肺泡上皮细胞Tie蛋白表达的影响

与A组相比，给予20%机械应力牵张的A549细胞显著增加了Ang蛋白的表达(P＜0.05)。同C组相比，D组可降低Ang蛋白的表达水平，见图 3。

图 3 Western Blot检测Ang-2在各组之间的表达情况 A:静止对照组; B:机械牵张组; C:正常二氧化碳+机械牵张组; D:高二氧化碳+机械牵张组
3 讨论

越来越多的研究表明，高碳酸血症(HPC)在急性肺损伤(ALI)/ARDS的损伤修复过程中发挥重要作用，ARDSnet的大样本随机对照研究表明，同高潮气量通气相比，允许性高碳酸血症患者生存率更高。HPC本身可通过减轻肺部炎症等作用来减少肺损伤。Kavanagh[4]的研究不仅支持允许性HPC的应用，而且提倡通过增加CO2的吸入量提高PaCO2来达到治疗性高碳酸血症目的。其给内毒素肺损伤小鼠吸入5%的CO2形成HPC，结果证实HPC能减少肺氧的消耗，提高肺顺应性，减少肺中性粒细胞的渗出，并减少肺损害的组织学指标，明显改善ALI大鼠的各项指标, 包括氧合状况、肺顺应性、气道峰压、肺毛细血管通透性及生存率。本研究采用体外实验证实，高碳酸环境下，机械牵张导致的肺泡上皮细胞损伤减轻，炎性因子释放下降，说明HPC可对VILI发挥保护作用。

多项研究表明，机械通气时，过度牵拉肺组织会使异常的机械力作用于细胞，激活NF-κB信号传导通络，导致一系列炎性介质如：TNF-α，IL-8，MCP-1等升高，导致严重的炎性反应[5]，其中TNF-α和IL-8具有重要作用，IL-8的主要作用是调节中性粒细胞趋化性，促进中性粒细胞移出内皮细胞，促进细胞脱颗粒及其吞噬功能。TNF-α可刺激IL-8的释放。肺泡型上皮细胞、支气管上皮细胞、肺内巨噬细胞均可产生IL-8。在兔肺复张模型试验中发现IL-8的浓度及IL-8 mRNA水平均增高，促进肺复张性肺水肿发生及加重。对ALI患者测定肺泡灌洗液中IL-8水平表明，IL-8水平升高与中性粒细胞水平升高相一致，因此IL-8被认为是严重肺损伤的早期标志[6]。

LDH是细胞能量代谢中的重要酶，可催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP，细胞受损或者死亡后，细胞膜破裂[7]，LDH从胞质中释放，因此LDH可反映细胞损伤情况，本研究发现，机械牵张肺泡上皮细胞可引起细胞释放LDH增加，而经高二氧化碳孵育的牵张细胞则LDH释放降低，说明在高二氧化碳环境下，牵张细胞损伤更小。

Ang-2是一种血管内皮生长因子，可与内皮细胞特异性受体Tie-2相结合，进而与Ang-1竞争性结合Tie-2，从而导致Ang-1与Tie-2结合发挥作用减弱，导致血管通透性增高，引起血管渗漏[8]。研究发现急性肺损伤患者血清中Ang-2的含量明显升高，并在体外实验中应用患者血清可破坏内皮细胞屏障，且内皮细胞屏障作用的破坏程度与Ang2水平呈现明显相关性[9]；另有研究在体外单独使用Ang2也可破坏内皮细胞屏障功能，并引起了明显的肺血管渗漏和肺水肿，目前是靶向干预和治疗ALI/ARDS的新措施[10]，本研究证实，Ang-2参与了VILI的致病过程，HPC减轻VILI可能系通过Ang-2参与所致。

综上所述，本实验研究结果显示，机械牵张肺泡上皮细胞可促进TNF-α和IL-8的表达增加，降低细胞的活力，而高碳酸环境则可以减轻机械牵张所致人肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤，上述研究结果有助于丰富和完善HPC干预VILI的机制理论，为探索进一步的治疗提供思路。

参考文献
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