胰腺癌是排名第10位的人类常见恶性肿瘤，在发达国家的男女人群中是导致与癌症相关死亡的第4位最常见原因^[1]。外科手术仍然是治愈的最好方法。由于大多数病人发现时已处于中晚期，失去手术治疗机会，其5年生存率只有3%^[2]。治疗进展期胰腺癌的化疗药物有限，且不能明显提高患者的生存率，因此，亟需研发一种新型药物来预防和治疗胰腺癌。维生素D3又名骨化三醇，在钙磷代谢中发挥着重要作用。Williams等^[3]发现血清维生素D的缺乏可促进乳腺癌的转移。近年来有研究报道维生素D3可通过阻断Hedgehog信号通路在多种肿瘤中发挥抗瘤作用。Hedgehog信号通路成员主要包括Hedgehog配体、PTCH受体、Smoothened(Smo)受体、Gli转录因子家族及下游的其他信号分子^[4]。Cortes等^[5]发现维生素D3通过与细胞膜上的Smo受体的固醇结合区相互作用来拮抗Hedgehog信号通路，从而调节造血干细胞的产生。本研究应用不同浓度维生素D3干预胰腺癌PANC-1细胞，检测Hedgehog信号通路中Smo蛋白表达的变化及对细胞迁移能力的影响，探讨维生素D3抗胰腺癌的作用机制。

人胰腺癌PANC-1细胞购自中国科学院上海细胞库。

RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；孔径8 μm的Transwell小室为BD Biosciences公司生产。Smo多克隆抗体购自abcam公司；β-actin、HRP标记羊抗兔二抗及抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；常规生物化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。维生素D3(纯度99.9%)购自Sigma公司。

维生素D3用无水乙醇稀释成100 mmol/L，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，4 ℃保存。

人胰腺癌PANC-1细胞在RPMI 1640培养液(含10%FBS及100 U/L的青-链霉素双抗), 37 ℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，每2 d更换培养液, 0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验。每个浓度设5个复孔，实验重复3次。

分别收集阴性对照组、25、50、75、100 μmol/L的维生素D3干预PANC-1细胞48 h后的细胞，提取蛋白，Bradford法测定蛋白含量，制备Western上样样品，进行SDS-PAGE胶电泳；将电泳分离的蛋白电转膜至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)封闭PVDF膜2 h；加兔抗人Smo一抗(1:400，3% BSA TBST稀释)4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5 min/次；加HRP标记羊抗兔二抗(1:50 000，3% BSA TBST稀释)孵育2 h，TBST洗涤PVDF膜5-6次，5 min/次；内参使用β-actin(鼠抗人，稀释度1:1 000)。ECL化学发光，X线胶片曝光，凝胶成像系统扫描，以目的条带与β-actin条带灰度值的比值代表蛋白的表达水平。

体外细胞迁移实验采用孔径8.0 μm的24孔transwell小室。实验分为阴性对照组及25, 50, 75, 100 μmol/L不同浓度维生素D3处理组。取对数生长期的用无血清处理12-24 h的PANC-1细胞，经消化离心后，用无血清DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/ml，取200 μl含或不含药物处理的细胞悬液加入到24孔Transwell小室的上室，24孔板下室加入加入800 μl含10% FBS的RPMI 1640培养基，下层培养液和小室间避免有气泡产生，37 ℃，5% CO₂培养箱培养18 h。取出小室，PBS清洗2次，10%甲醇溶液固定30 min，5%结晶紫染液室温下染色20 min，PBS清洗2遍，200倍显微镜下拍照，随机选择5个视野计数，取平均值。每组细胞设5个复孔，实验重复3次。迁移抑制率%=(1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。实验数据用x±s表示，用单因素方差分析或t检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1显示，不同浓度维生素D3处理胰腺癌PANC-1细胞48 h后，阴性对照组及25, 50, 75, 100 μmol/L组细胞Smo/β-actin灰度值分别为：0.579±0.120, 0.409±0.090, 0.289±0.075, 0.182±0.034, 0.068±0.019，随浓度的增加而下调，差异有统计学意义(F=19.781，P＜0.05), 其中50, 75, 100 μmol/L组与阴性对照组，100 μmol/L组与25, 50, 75 μmol/L组之间的差异均有统计学意义(P＜0.05)，以100 μmol/L组的作用最强。

图 1(Figure 1)

图 1 不同浓度(0，25，50，75，100 μmol/L)维生素D3干预PANC-1细胞48 h对Smo蛋白表达的影响 1:阴性对照组；2: 25 μmol/L组；3: 50 μmol/L组；4: 75 μmol/L组；5: 100 μmol/L组；与对照组比较，*P＜0.05, 与前一浓度组比较，**P＜0.01

Transwell小室检测维生素D3对胰腺癌PANC-1细胞迁移能力的影响。如图 2所示，分别用25, 50, 75, 100 μmol/L的维生素D3处理细胞24 h后，穿到Transwell小室下面的细胞数与对照组相比均明显减少(P＜0.01), 且各个浓度组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。25, 50, 75, 100 μmol/L维生素D3对细胞的迁移抑制率分别为(15.45±1.35)%、(37.26±2.11)%、(69.96±2.71)%、(84.55±2.83)%。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度(0, 25, 50, 75, 100 μmol/L)维生素D3干预PANC-1细胞24 h对细胞迁移的影响(×200) A:阴性对照组；B: 25 μmol/L组；C: 50 μmol/L组；D: 75 μmol/L组；E:100 μmol/L组, **P＜0.01

胰腺癌早期难以发现，恶性程度高，传统治疗方法(手术、放疗、化疗、靶向治疗以及生物治疗)其治疗效果不尽如人意，预后差，发病率和死亡率逐年上升^[6]，已成为严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。通过对胰腺癌发病的分子生物学机制的了解，可以更好地明确胰腺癌的发生发展机制，有利于对胰腺癌的预防和早期发现、早期诊断和早期治疗。胰腺癌的发病主要涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及基因组维护基因的功能异常，它们通过一条或多条信号通路引起细胞增殖、凋亡、分化等基本生命过程的调控异常，导致细胞不断恶化，最终导致肿瘤的形成。与胰腺癌的发生、发展相关的信号通路包括Notch、Hedgehog、Wnt和TGF-β信号通路，其中Hedgehog信号通路成为近些年来研究的热点。Bai等^[7]报道通过阻滞Hedgehog信号通路可有效抑制胰腺癌细胞的增殖、促进其凋亡，延缓其恶性进展，从而发挥抗胰腺癌的作用。

维生素D3是一种新发现的Hedgehog信号通路阻滞剂。Kennel等^[8]报道血清维生素D3的水平异常与多种肿瘤的发生有关。Uhmann等^[9]研究表明维生素D3通过Hedgehog信号通路能够拮抗基底细胞癌、人类肾细胞癌、胚胎横纹肌肉瘤、胃癌和胆管细胞癌、异种移植胰腺癌模型的生物学行为。Bijlsma等^[10]发现维生素D3以类似于环巴胺(已知的Smo受体拮抗剂)敏感的方式与Smo受体在体外高亲和力结合，而用维生素D3处理的斑马鱼胚胎模拟了Smo受体阴性的表型，从而在体内外实验中证实了其对Hedgehog信号通路的抑制作用与Smo受体直接结合相关。在生理情况下，由于缺乏Hedgehog配体，Smo的分子伴侣受体Ptch可以抑制Smo的活性，同时一种混合抑制因子(Sufu)与Gli转录因子家族特异性结合阻止了Hedgehog信号通路下游靶基因的激活，从而在Hedgehog信号通路中充当一种负性调节因子。一旦Hedgehog配体与Ptch结合之后，解除了Ptch对Smo的抑制作用，Smo蛋白从细胞质定位至细胞膜，促进了Sufu与Gli转录因子家族的解离，从而导致Hedgehog信号通路的激活^[11]。Mason等^[12]进一步提出假说认为Ptch受体表面的固醇感受区(SSD)在Smo蛋白活性的抑制中起着重要作用。目前普遍认为Ptch通过清除Smo受体周围的氧化型胆固醇来调节Smo的活性，当Ptch受体的SSD发生突变或者与Hedgehog配体结合时，Ptch受体的氧化型胆固醇泵被关闭，导致这些氧化型胆固醇在Smo受体周围的积聚，从而恢复了Smo对Gli转录因子家族的激活作用和在细胞膜上的定位^[13]。Albert等^[14]研究发现在Ptch受体发生突变的异种移植小鼠皮肤肿瘤模型和基底细胞癌细胞中，维生素D3通过靶向抑制Hedgehog信号通路从而在体内外发挥其抗肿瘤效应，提示了维生素D3是在Smo蛋白的水平上发挥Hedgehog信号通路阻滞作用的。

然而，Teichert等^[15]在野生型小鼠皮肤肿瘤模型中发现维生素D3的干预抑制了Hedgehog信号通路相关分子的表达，在维生素D受体基因敲除(VDR-KO)小鼠中却未发现这种现象，提示维生素D3可能通过维生素D受体(VDR)途径来调控Hedgehog信号通路。Uhmann等^[16]研究发现维生素D3在基底细胞癌中的抗肿瘤作用与Hedgehog信号通路的抑制和VDR信号通路的激活相关，且2条信号通路相互独立。维生素D3是通过某条单独的信号通路，还是通过2条通路的协同作用来调控肿瘤的发生及发挥抗瘤作用，尚需进一步研究。

本研究结果显示，不同浓度的维生素D3干预胰腺癌PANC-1细胞后，Smo蛋白的表达随浓度的增加而下调，以较大剂量更为明显(50, 75, 100 μmol/L)，表明了维生素D3对Hedgehog信号通路的抑制作用。本研究结果还显示，维生素D3可以有效抑制PANC-1细胞的迁移，在较大浓度组(75, 100 μmol/L)的迁移抑制率增加更为明显。维生素D3处理后，Smo蛋白呈浓度依赖性的表达下调，表明了维生素D3可通过抑制Hedgehog信号通路中Smo蛋白的表达进一步抑制胰腺癌PANC-1细胞的迁移，从而发挥抗胰腺癌作用。