皮肤衰老是人体衰老的一部分，研究表明，皮肤衰老与紫外线照射导致的正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblasts, NHSFs)氧化应激损失密切相关。β-联蛋白(β-catenin)是转录因子共激活剂，它在调控细胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有着非常重要的作用，有研究显示高表达的β-catenin对氧化应激所致的NHSFs衰老相关表型具有调控作用^[1]，但其具体作用机制还不甚清楚。本研究通过在NHSFs中转染pcDNA3.1-β-catenin，并用中波紫外线(UVB)进行氧化应激处理，研究高表达的β-catenin对NHSFs的作用，并通过检测细胞衰老相关因子FOXO3a的表达来探讨其作用机制。

高糖DMED培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(Gibco)、Clinibio 128C型酶标仪(奥地利ASYS Hitech公司)；PCR仪(美国Perkin Elmer公司)；Universal Hood Ⅱ型紫外凝胶成像系统(意大利Bio-Rad公司)；台式紫外线辐射仪(上海希格玛公司)；中波紫外线(UVB)探测仪(比利时Bioblock Scientific公司)；CH倒置光学显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)；Luciferase reporter system kit (美国Promega公司)；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(美国CDK公司)；新生牛血清(美国Gibco公司)；质粒pcDNA3.1-β-catenin载体(美国Clontech公司)；流式细胞仪(德国Miltenyi Biotec GmbH公司)；大肠杆菌DH5α由华中科技大学同济医学院实验室惠赠，用于质粒扩增。

经患者监护人知情同意并经我院伦理委员会批准后，收集我院泌尿外科儿童包皮环切术切除的多余包皮组织。去除皮下脂肪及血管, 采用组织块法分离获得包皮成纤维细胞。高糖DMED培养基加10%胎牛血清培养，细胞长至90%融合后以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后传代培养, 取第3代细胞进行实验。

参考文献并结合我们前期实验，采用亚毒性剂量的UVB (10 mJ/cm²)连续5次照射第3代NHSFs诱导人皮肤细胞衰老模型^[3]，通过以上NHSFs衰老模型来模拟人皮肤衰老。

UVB处理培养基孵育2 h后弃去，PBS洗3遍，换新鲜培养基继续培养72 h。按试剂盒说明书操作进行SA-β-gal活性测定，吸除细胞培养基，用PBS洗涤1次，加入适量SA-β-gal染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，加入PBS洗涤3次，每次3 min。吸除PBS，加入适量细胞染色工作液，37 ℃孵育12 h，中性树胶封片，光学显微镜观察。阳性细胞(衰老细胞)镜下呈淡蓝至深蓝色。标本阳性率以阳性标本占总标本数的百分率表示。

大肠杆菌DH5α扩增质粒pcDNA3.l-β-catenin，PCR和DNA测序来鉴定。通过脂质体Lipofectamine^TM 2000将pcDNA3.l-β-catenin和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)共同转染到NHSFs中，转染后细胞继续孵育48 h，然后用Luciferase reporter system kit检测荧光素酶的活性，鉴定细胞转染率。

将pcDNA3.l-β-catenin和GFP共同转染到NHSFs中，然后UVB处理组作为实验组，命名为NHSFs+β-catenin+UVB组；空载体pcDNA3.1转染到NHSFs中，命名为NHSFs+vector组；空载体pcDNA3.1转染到NHSFs中，然后UVB处理命名NHSFs+vector+UVB组，后两组为对照组，分别检测各组细胞凋亡率。

分别检测NHSFs+β-catenin+UVB组、NHSFs+vector组、NHSFs+vector+UVB组中β-catenin和FOXO3a蛋白的表达，具体实验方法参考文献[4]。

所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析。所有计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，计量资料用t检验，计数资料用χ²检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

采用组织块法培养第4天开始有细胞从组织块边缘爬出, 第10-14天细胞长至融合，长梭形细胞中间可见铺路石样细胞表皮细胞，将融合细胞按1:3进行传代，传代后细胞生长加速第2天可融合，从第2代开始细胞呈典型的长梭形，铺路石样表皮细胞消失。

UVB 10 mJ/cm²能量照射后可见细胞生长停滞呈典型衰老形态，细胞形态上变得宽大扁平，胞质透明，胞核内颗粒增多，见图 1。SA-β-gal半乳糖苷酶细胞衰老染色可见典型衰老细胞核周染成蓝色, 对照组细胞阳性率为(34.25±1.63)%。

图 1(Figure 1)

图 1 UVB诱导成纤维细胞SA-β-gal染色 A: UVB处理前; B: UVB处理后

用荧光素酶检测荧光转染率大概30%左右，pcDNA3.1-p-catenin载体成功转染入NHSFs细胞中，见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 荧光素酶检测β-catenin转染率 A:NHSFs+β-vector组荧光转染率；B:NHSFs+β-catenin组荧光转染率

转染pcDNA3.l-β-catenin进入NHSFs中后，为了评估各实验组细胞凋亡情况，我们检测了各个实验组细胞凋亡情况，见图 3。在NHSFs+vector, NHSFs+vector+UVB，NHSFs+β-catenin+UVB组中细胞凋亡水平分别是:(2.98±0.19)%、(25.14±3.24)%、(16.43±2.46)%。我们发现，在NHSFs+vector+UVB组中细胞凋亡率较高，而在NHSFs+β-catenin+UVB组中细胞凋亡率降低(P < 0.05)。

图 3(Figure 3)

图 3 各组细胞凋亡率情况 A：NHSFs+vector组；B：NHSFs+vector+UVB组；C：NHSFs+β-catenin+UVB组

见图 4。β-catenin/GAPDH蛋白的比值在NHSFs+vector, NHSFs+vector+UVB, NHSFs+β-catenin+UVB组分别是0.63±0.03、0.21±0.18、0.47±0.09。FOXO3a/GAPDH蛋白的比值在NHSFs+vector, NHSFs+vector+UVB, NHSFs+β-catenin+UVB组分别是0.89±0.59、0.24±0.02、0.48±0.76。上述数据表明:FOXO3a蛋白的水平在NHSFs+vector+UVB组明显低于NHSFs+vector组(P < 0.05)，并且，FOXO3a的表达水平在NHSFs+β-catenin+UVB组较NHSFs+vector+UVB组高(P < 0.05)。

图 4(Figure 4)

图 4 Western印迹测定NHSFs中β-catenin和FOXO3a蛋白的表达情况 1：NHSFs+vector组；2：NHSFs+vector+UVB组；3：NHSFs+β-catenin+UVB组

皮肤衰老与紫外线特别是中波紫外线(UVB)密切相关，紫外线诱导皮肤衰老已有多年的研究，技术成熟^[5], β-catenin是细胞质中一种重要的多功能蛋白，可以通过Wnt信号通路发挥抗细胞凋亡作用^[7]，近期研究发现β-catenin及其信号通路在调控细胞衰老中起着重要作用^[6]，但其抗细胞衰老的机制不甚清楚。

在细胞衰老的相关研究中发现，FOXO3a是叉头(Forkhead)蛋白家族成员之一，FOXO3a蛋白可通过与相应的DNA结合调控下游因子，在细胞增殖凋亡、细胞周期阻滞、血管新生、DNA修复及应激反应中发挥重要作用^[8-10]。FOXO3a通过相关信号通路可以抑制氧化应激从而达到延缓衰老^[11]，活性氧(ROS)与衰老过程密切相关，而FOXO3a可以通过激活superoxide dismutase 2 (SOD2)和catalase (CAT)减少ROS的含量^[12]，通过激活FOXO3a和Nrf2通路，可以增加下游的抗氧化剂，包括SOD2, CAT, GR, GSH, GCL, HO-1等基因的表达与功能，有助于对D-半乳糖衰老的保护^[13]。

进一步研究发现，β-catenin和FOXO3a之间可以通过相互作用增强细胞对氧化应激的适应能力，通过Wnt/β-catenin信号通路，FOXO3a的同源基因DAF-16和β-catenin同源基因BAR-1相互作用对氧化应激诱导起到非常重要的作用^[14]。除了Wnt/β-catenin信号通路，FOXO3a还可以通过AKT、JNK等信号通路抑制氧化应激，延缓细胞衰老^[15]，这种抗氧化应激的机制包括:提供FOXO3a转录因子核定位的信号抑制FOXO磷酸化和FOXO3a结合MhSOD启动因子减少ROS的活性等方面^[16]。

我们通过培养第三代成纤维细胞，转染pcDNA3.l-β-catenin进入NHSFs中，并用中波紫外线诱导皮肤衰老模型，检测转染pcDNA3.1-β-catenin后对NHSFs中β-catenin和FOXO3a表达的影响，我们的数据表明了，高表达的β-catenin激活了FOXO3a，从而上调了FOXO3a的表达。而FOXO3a的表达上调可以抑制细胞衰老，这可能是β-catenin抗细胞衰老的作用机制之一，具体作用机制还需要我们进一步研究。