2. 南京中医药大学第一临床医学院 江苏 南京 210023
2. First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
产后抑郁症(postpartum depression, PPD)是产褥期精神综合征中最常见的一种类型,以分娩后出现情绪低落,精神抑郁为主要症状,临床以沮丧、悲伤、哭泣、易烦躁、易激动,甚至出现幻觉,或有自杀及伤婴等一系列表现。PPD严重危害产妇及婴儿身心健康,给家庭和社会也带来严重影响。PPD被认为是难治性抑郁[1]。由于一线抗抑郁西药的副作用及局限性,不能有效地治疗PPD,因此寻找快速安全有效且无明显副作用的中药变得迫切而实际。
越鞠丸出自《丹溪心法》,功能行气解郁,是治疗抑郁症的经典方剂,临床上常用于抑郁症的治疗[2]。本课题组前期研究发现越鞠丸对多个品系的小鼠模型具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁作用[3, 4],但该作用未在PPD动物模型上得到证实。
PPD的产生与多种因素相关,既往的应激性生活事件被认为是PPD发病的重要风险因素[5]。本研究探索以孕前应激法构建BALB/c小鼠PPD模型,以越鞠丸醇提物干预,观察越鞠丸对PPD模型小鼠的作用,以研究孕前应激对PPD致病的影响并验证越鞠丸对PPD的快速抗抑郁作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级健康成年雌性BALB/c小鼠40只,体质量18-24 g,军事医学科学院提供,动物合格证号:2007000581303。适应性饲养1周后用于实验。动物房室温25 ℃、湿度为45%,明暗交替时间为12 h,动物可以自由饮食进水。
1.2 越鞠丸醇提物(Yueju ethanol extract, YJ)制备实验用中药材购于南京中医药大学国医堂门诊,经本校药学院专家鉴定,为中国药典收载品种。取苍术、神曲、香附、栀子、川芎5种药材粉碎,过100目筛,按等分重量混合后浸泡在95%乙醇中(6倍体积)48 h,期间不停搅拌。静置后取上清,同样过程重复两次,收集3次的上清液后过滤,减压浓缩至无乙醇。加入Tween-80作为乳化剂(终浓度为0.5%),配制为实验所需浓度-20 ℃保存备用。将浓缩后的YJ进行高效液相色谱(HPLC)分析,按照实验室之前确立的方法[3]检验不同批次YJ的指纹图谱及稳定性,并对其主要成分定量分析以进行质控。
1.3 实验试剂盐酸氯胺酮(ketamine, Ket)注射液为福建古田制药厂生产(批号:20140301)。临用前用生理盐水配成30 mg/ml的药液。盐酸氟西汀(Fluoxetine,Flx)为美国Sigma公司产品,根据Dulawa方法[6]以生理盐水配成浓度18 mg/kg的药液。
1.4 实验方法 1.4.1 动物分组及模型的制备小鼠随机分为2组:空白对照组(n=8)和孕前应激组(n=32),空白对照组不予任何应激,孕前应激组小鼠每天给予6 h束缚应激刺激(11:00-17:00)。3周后将孕前应激组以一雌一雄分笼交配饲养。大约4周后,母鼠分娩,被定义为PPD模型组(Mod)。将模型组母鼠随机分为Mod组(n=8),YJ组(n=8),Ket组(n=8),Flx组(n=8)。Flx组自产后第1天始每日腹腔注射Flx注射液每10 g体重0.1 ml (相当于每克小鼠给予氟西汀0.018 mg),持续21 d。产后第20天,根据薛文达等[3]的研究结果,YJ组予YJ浓度13.5 g/kg,以每10 g体重0.1 ml灌胃(相当于每克小鼠给予越鞠丸生药0.013 5 g),Ket组予Ket注射液每10 g体重0.1 ml腹腔注射(相当于每克小鼠给予氯胺酮0.03 mg),24 h后,检测各组母鼠的一系列行为学表现。
1.4.2 小鼠的行为学测试指标 1.4.2.1 蔗糖偏好试验(sucrose preference test, SPT)根据Dulawa方法[7]改进,在应激之前,对应激组和空白对照组予两瓶2%蔗糖溶液适应3 d。禁水禁食18 h后,小鼠单笼饲养,每笼给予一瓶2%蔗糖溶液和一瓶自来水,观察2 h蔗糖消耗量。蔗糖消耗计算公式为:蔗糖偏好百分比(%)=[(蔗糖摄入量)/(蔗糖摄入量+水的摄入量)]×100[8]。
1.4.2.2 强迫游泳实验(forced swim test, FST)将小鼠分别放入玻璃烧杯中,水温保持在24-26 ℃。让小鼠在其中游泳2 min后,立刻开始观察记录接下来的4 min内小鼠总的不动时间:即小鼠在水中停止挣扎,或呈漂浮状态,仅有细小的肢体运动。
1.4.2.3 悬尾实验(tail suspension test, TST)采用上海吉量软件公司的悬尾测试视频分析系统,用胶带将小鼠悬挂于距台面30 cm的支架边缘上,胶带tt粘贴位置在距小鼠尾尖1 cm处。每只小鼠共悬挂5 min,记录其在最后4 min的不动时间。
1.4.2.4 陌生环境摄食实验(novelty suppressed feeding test, NSFT)小鼠禁食24 h后,被放置在一个新的鼠笼内,底部铺上厚约1 cm的垫料,中心放置已经称重的粮食。放入后,检测小鼠开始吃食的潜伏时间。以吃食的潜伏期和消耗食物的重量为观测指标。如果小鼠5 min内没有吃食则定义为潜伏时间是5 min。小鼠单位时间摄食量(g)=5 min内消耗粮食重量(g)/小鼠体质量(g)。
1.5 统计学处理测量结果以x±s表示,应用SPSS 20.0统计分析软件对多组间数据进行单因素方差分析,post hoc test选用LSD方法,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 单次给予YJ能够提高PPD模型母鼠的蔗糖消耗百分比结果显示,模型母鼠蔗糖消耗百分比较空白对照组显著减少(P<0.01);YJ组和Ket组母鼠的蔗糖消耗百分比较模型组均明显增多(P<0.01,P<0.01),YJ组与Ket组无显著性差异。与模型组比较,Flx组无显著性差异。结果见图 1。
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图 1 各组小鼠的蔗糖消耗百分比 Con:空白对照组,Mod:模型组,YJ:越鞠丸醇提物组,Ket:氯胺酮组,Flx:氟西汀组; 与空白对照组比较, ***P<0.01;与模型组比较, ###P<0.01 |
结果显示,模型母鼠强迫游泳及悬尾测试的不动时间明显增加,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01);YJ组和Ket组母鼠的不动时间较模型组均显著降低(P<0.01,P<0.01),YJ组与Ket组无显著性差异。与模型组比较,Flx组无显著性差异。结果见图 2、图 3。
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图 2 各组小鼠强迫游泳的不动时间 ***P<0.01,与空白对照组比较;###P<0.01,与模型组比较 |
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图 3 各组小鼠悬尾测试的不动时间 ***P<0.01,与空白对照组比较;###P<0.01,与模型组比较 |
结果显示,模型母鼠在陌生环境中摄食中潜伏期显著延长(P<0.01,见图 4A),单位时间摄食量明显减少(P<0.01,见图 4B);给予YJ及Ket干预后,均能明显缩短摄食潜伏期(P<0.01,P<0.01),增加单位时间摄食量(P<0.01,P<0.01)。YJ组与Ket组无显著性差异。与模型组比较,Flx组无显著性差异。结果见图 4。
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图 4 各组小鼠陌生环境摄食的潜伏时间及单位时间摄食量 ***P<0.01,与空白对照组比较;###P<0.01,与模型组比较 |
产后抑郁的病因复杂,与生物、社会、心理等因素密切相关。有学者发现PPD与多个风险因子有明显的关系,包括心理社会应激,不良生活事件,既往和家庭心境障碍史等多方面因素[9]。既往的应激性生活事件被认为是PPD发病的重要风险因素[5],可能是因为持续的应激能增加易感性个体发生情感障碍的可能性。
本实验中,我们采用慢性孕前应激对适龄BALB/c雌鼠造模,通过对产后3周母鼠的蔗糖偏好试验、强迫游泳测试、悬尾测试及陌生环境摄食测试评估该PPD模型,发现该模型小鼠出现了快感缺失,兴趣下降,行为绝望以及伴有焦虑现象,这与PPD患者的临床症状极为相似,因此模型的建立是成功的。
常规的PPD西医治疗主要包括心理治疗和抗抑郁药物治疗。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRIs)类是目前抗抑郁治疗中应用较多的一线抗抑郁药物。氟西汀是SSRIs类代表药物,但其临床上存在起效缓慢、影响哺乳等不良反应,且有三分之一的病人对其无治疗反应[10]。本实验中,连续21 d的氟西汀给药对孕前应激诱导PPD模型小鼠的一系列抑郁样行为均无明显作用,提示该模型可能是一种难治性抑郁模型。这与目前研究认为PPD属于难治性抑郁的观点相一致[1]。目前越来越多的学者致力于寻求能够治疗难治性抑郁的快速起效抗抑郁药物。
NMDAR (N-methyl-D-aspartate Receptor)的拮抗剂氯胺酮目前被公认为是可用于治疗难治性抑郁、具有快速抗抑郁作用的药物[11]。在临床研究及动物实验上,单次亚麻醉剂量的氯胺酮即可发挥快速持久的抗抑郁的作用[12]。但是,由于氯胺酮具有的神经毒性和成瘾性等副作用,使其不能用于临床。我们可以氯胺酮为阳性参照,寻找具有与其一致的快速抗抑郁作用且没有其副作用的理想药物。
近代中医认为产后抑郁症可归属于中医“郁病”范畴。产后抑郁病因复杂,几种病因又相兼为病,虚实夹杂,以郁为主。同时现代女性由于受家庭、生活等方面的压力,郁证尤多,出现“六郁并集、诸郁并见”的病因病机。这与朱丹溪对于郁证的认识相同。丹溪指出:“气血冲和,万病不生,一有怫郁,诸病生焉”并创立了越鞠丸。《丹溪心法》云:“越鞠丸,解诸郁”。该方由苍术、川芎、香附、神曲、山桅组成,专为郁病而设,重在理气解郁,兼顾六郁。
古往今来越鞠丸作为治疗抑郁症的经典方剂,许多学者对其进行了研究。于雷[13]统计了近30年的越鞠丸治疗抑郁症的临床案例,发现其总有效率达93.65%,且副作用很低。尉小慧[14]对越鞠丸抗抑郁活性进行研究,发现越鞠丸抗抑郁样作用是全方配伍综合作用的效果。本课题组前期发现[4]以越鞠丸单次给药,在ICR和昆明小鼠上具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁功效。本研究发现单次给予YJ 24 h后能够显著改善孕前应激PPD小鼠模型的行为学指标。与PPD模型组相比,YJ组显著增加模型母鼠的糖水偏爱百分比,降低模型母鼠在强迫游泳测试和悬尾测试中的绝望不动时间,缩短模型母鼠陌生环境摄食测试中的潜伏时间和增加其单位时间内摄食量,差异均有统计学意义。本研究发现在孕前应激PPD小鼠模型上,YJ具有与氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。
总之,孕前应激诱导的PPD小鼠模型是一种具有实验研究价值的PPD动物模型。常规抗抑郁药物氟西汀的慢性给药对该模型无明显治疗作用,提示该模型可能是一种难治性抑郁模型。而YJ对PPD小鼠模型具有与氯胺酮相似的快速抗抑郁作用,提示越鞠丸可用于治疗难治性抑郁。本研究为快速治疗PPD的中药新药研发提供了依据,可以更好地指导产后抑郁症的治疗。
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