视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是婴幼儿最常见的眼部恶性肿瘤，约占儿童全部恶性肿瘤的4%。RB发病率约为1:18 000至1:21 000 ^[1]，我国每年新发患儿数在1 100-1 500例左右。在欧美国家，RB患儿5年生存率已超过95%，而全球包括我国的平均5年生存率约为50%^[2]。对RB的早期确诊和规范治疗一直是眼科肿瘤研究的热点，目前，还没有一种早期评判预后的有效标记物。

Ki67及Bax在视网膜母细胞瘤中的表达及对预后的影响Ki67为细胞增殖抗原标记，与多种恶性肿瘤的发展、转移和预后有关，能反映全部增殖细胞的数量。Bax是一种促进凋亡的基因, 与bcl-2基因作用相反，细胞内二者的含量之比决定该细胞受刺激后的生存与凋亡。诱导瘤细胞凋亡是治疗RB的手段之一。我们应用免疫组织化学的SP法研究了Ki67、Bax在RB中的表达。并探讨它们与病理组织分化类型、临床预后之间的关系。

选取从2013年9月到2017年10月，武汉大学人民医院眼科中心住院行眼球摘除或眶内容物剜除术，资料完整的48个视网膜母细胞瘤的组织蜡块和相应的病历纳入研究。记录性别、眼别、临床分期、手术时的年龄、病程、手术范围、是否转移、电话随访或查阅复诊病历并记录是否存活等。其中，男性25例，女性22例。就诊时患儿年龄0.5-7岁，平均26.4个月。通过病理科教授复查病理切片筛选出有代表性的蜡块，复查切片时对HE染色的切片在光镜下照相，并分型。分化型肿瘤蜡块20个，未分化型28个。眼内期43个，青光眼期3个，眼外期2个。记录坏死和钙化的程度，记录坏死面积占组织切片面积的百分比。记录脉络膜、巩膜、前房、视神经是否受肿瘤侵犯。

小鼠抗人Ki67单克隆抗体，小鼠抗人Bax单克隆抗体，免疫组织化学SP试剂盒，DAB显色剂，TUNEL试剂盒。

LeicaRM2128石蜡切片机(上海)，奥林帕斯双目自动照相显微镜(日本)。

石蜡标本进行4 μm厚连续常规切片。每个蜡块制作4个切片，2个用于不同抗体免疫组化染色，一个用于TUNEL检测，一个备用。每张切片随机选10个高倍视野，在光镜下观察照相。

细胞凋亡检测按试剂盒说明书操作，中性树胶封片显微镜下观察照相，计算凋亡细胞占肿瘤细胞的百分率就称作凋亡指数(apoptosis index，AI)。

背景干净, 出现明显棕黄色物质为阳性。Ki67定位于细胞核; Bax定位于细胞质。结果判断标准:背景同阴性对照、无着色细胞或者阳性细胞百分数 < 5%为阴性(-), 阳性细胞呈淡棕黄色或者阳性细胞率5%-50%为弱阳性(+); 阳性细胞呈深棕黄色或阳性细胞率＞50%为强阳性(++)。

SPSS 17.0软件包用作统计学分析，临床病理学指标与免疫组化指标之间的相关性分析采用χ²检验、独立样本t检验和U检验，P＜0.05判定为有统计学意义。

48个肿瘤蜡块中Ki67和Bax蛋白分别有48个和38个切片的阳性细胞率超过5%，被认为阳性表达，分别得到各自的阳性细胞率100%和79%。正常视网膜各层未见上述指标阳性表达。

TUNEL染色可见各个时期的凋亡细胞。染色阳性物质呈棕黄褐色颗粒样，位于细胞核内，与核膜紧贴。凋亡细胞体积缩小，有致密的染色质聚集，可见断裂的核碎片。48个标本的平均AI为2.5%。

见表 1。临床病理学特征与免疫组化指标相关性统计学分析结果见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 RB患儿的临床特征及蜡块的病理组织学特征一览表 特征 n(%) 性别   男 26(54.2)   女 22(45.8) 眼别   单侧 46(95.8)   双侧 2(4.2) 分期   眼内期 43(89.6)   青光眼期 3 (6.3)   眼外期 2 (4.1) 手术范围   眼球摘除 45(93.4)   眶内容剜出 3(6.6) 预后   存活(0.5-3年) 37(77.1)   去世 11(22.9) 侵袭   脉络膜浸润 21(43.8)   未侵袭 27(56.2) 组织分型   分化型 20(41.7)   未分化型 28(58.3) 肿瘤直径(mm)   ＜15 16(33.3)   ≥15 32(66.7) 坏死率(%)   ＜50 37(77.1)   ≥50 11(22.9) 钙化   无 14(29.2)   有 34(70.8)

表 1 RB患儿的临床特征及蜡块的病理组织学特征一览表

表 2(Table 2)

表 2 临床病理学特征与免疫组化指标相关性统计学分析结果 相关性检验内容 统计学结果 未分化型肿瘤与脉络膜受侵犯 P=0.061* 未分化型肿瘤与肿瘤直径(mm)≥15 P=0.002* 未分化型肿瘤与转移死亡 P=0.073* 坏死率≥50%与脉络膜受侵犯 P=0.042* 肿瘤直径(mm)≥15与脉络膜受侵犯 P=0.035* 肿瘤直径(mm)≥15与钙化 P=0.001* 凋亡指数＜2.5%与手术方式(眼球摘除) P=0.072△, U=56.0 凋亡指数＜2.5%与转移死亡 P=0.025* 增殖指数≥42.9与肿瘤直径(mm)≥15 P=0.001#，t=6.01 增殖指数≥42.9与转移死亡 P=0.057△，U=59.0 肿瘤直径(mm)≥15与转移死亡 P=0.044, t=3.17 视神经残端侵犯与转移死亡 P=0.024, t=2.52 *Fisher确切概率法; #独立样本t检验; △非成对样本U检验

表 2 临床病理学特征与免疫组化指标相关性统计学分析结果

Ki67与Bax表达呈负相关，Ki67增殖指数与AI也呈负相关，直线相关系数分别为0.84(P=0.032)和0.90(P=0.04)。

脉络膜受侵犯的标本，肿瘤坏死率往往超过50%(P=0.042);肿瘤直径超过15 mm的标本往往合并脉络膜受侵犯(P=0.035)和更高的钙化率(P=0.001)。

临床上一般根据病理学特征(主要看临床分期，有无脉络膜、巩膜、视神经侵犯)判断是否有转移和复发的危险，决定下一步是否需要放、化疗和随访间期等。患儿眼球摘除术后复发和死亡的病例也存在。治疗的目标是保全生命的基础上保留眼球和保护残留的视力。本文患儿的平均就诊年龄为26.4月，高于1995年美国Augsburg报告的平均21.2个月的就诊年龄^[3]，与国内郑嵩山2008年所述^[4]的接近。分化型RB含较多呈大、小菊形团排列的F-W分化细胞和少量未分化细胞，恶性程度低; 未分化型RB则以未分化细胞为主或者全为未分化细胞，恶性程度高。这两型都可出现钙化、坏死、假菊形团等特征^[5]。我国的赵桂秋曾经观察到体外培养的RB细胞有高、低分化细胞相互转变的现象，结合RB组织中高低分化细胞有错杂排列的特点，推测RB瘤细胞分化程度与患儿的生存预后无直接关系^[6]。本文Ki67的表达的增殖指数与组织分化程度无明显相关关系，且未分化型肿瘤与转移死亡的相关性也无统计学意义。

Ki67蛋白在RB移植瘤细胞的细胞核呈棕黄色阳性表达。RB移植瘤的蔓延浸润能力与其细胞的增殖活性有关：增殖活性越高，其浸润潜能越大。本文结果显示：Ki67抗原与视网膜母细胞瘤的临床分期呈正相关，随着临床分期和视神经侵犯程度的增加，Ki67的表达增强。Ki67在视网膜母细胞瘤中的表达与患者性别、年龄、眼别及组织学分型无明显相关性。本文研究发现，48个RB组织中都有不同程度细胞凋亡现象，镜下瘤细胞凋亡多见于微血管密度低的区域及远离微血管的部位。可能由于瘤细胞的快速增生，压迫了肿瘤周围的微血管，致使瘤组织内部缺血缺氧而触发了瘤细胞的凋亡程序，并伴有瘤细胞坏死。

Ki67有望成为视网膜母细胞瘤基因治疗新的靶点。Ki67增殖指数(阳性率)与肿瘤大小呈正相关，与组织分化程度无关，与转移死亡也没有直接关系。AI降低，提示预后不良。