产前诊断是指应用影像学、血清学、细胞遗传学及分子生物学等检测技术，诊断胎儿是否患有先天性或遗传性疾病，为宫内治疗和选择性流产提供诊断依据，有利于提高人口素质、实行优生优育。目前最常用的实验室产前诊断方法有血清学筛查和羊水细胞培养的核型分析，尤其羊水的核型分析，诊断准确性较高。但是，该方法需要细胞培养，实验周期长，程序繁杂，技术要求高，且对孕周有一定要求，不能满足目前快速产前诊断的需求。因而，寻找一种快速、准确的产前诊断染色体非整倍体的方法是目前临床工作的迫切需要。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术利用DNA碱基对的互补性，将单链DNA探针和样本DNA进行杂交，由于探针标记了特异性荧光，可以方便地观察到杂交信号的有无和数量，以此来反映待测样本相应染色体有无非整倍体畸变。根据目前临床医学的研究，染色体异常活婴的95%是由于13号、18号、21号、X、Y染色体非整倍体数目异常造成^[1]。FISH检测有较高的准确度、灵敏度和特异度，并且具有操作简单、快速、重复性好等优势。因此，应用FISH检测能满足临床上大多数染色体病的产前诊断需要。

本研究通过比对247份孕中期羊水样本的FISH检测结果和染色体核型，探讨FISH技术在快速产前诊断中的临床价值。

选取2015年1月-2017年12月在武汉大学中南医院检验科细胞遗传实验室同时进行FISH检测和核型分析检测的247例孕中期羊水样本。其中孕妇年龄分布在18-45岁，孕周16-27周，产前血清学筛查21-三体综合征高风险51例，18-三体综合征高风险29例，13-三体综合征高风险5例，高龄产妇102例，超声诊断胎儿发育异常108例，不良孕产史30例，NIPT染色体数目异常24例，夫妇中一方染色体异常6例、近亲结婚1例，符合其中两项或两项以上指标者109例。所有孕妇均签署羊水穿刺培养产前诊断知情同意书。

在超声指引下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水20 ml放置于无菌离心管里，进行细胞遗传学诊断。其中用于羊水细胞培养的核型分析15 ml，用于FISH检测5 ml。

采用美国雅培公司提供的试剂和探针。试剂盒由两套探针组成：基因特异性探针GLP13(绿色荧光信号)/GLP21(红色荧光信号)和着丝粒探针CSP18(天蓝色荧光信号)/CSPX(绿色荧光信号)/CSPY(红色荧光信号)。按照试剂盒说明书操作，将未培养的羊水细胞进行羊水标本预处理、变性、杂交、洗涤、复染，封片等操作后，暗处放置2 h，于OLYMPUS BX53荧光显微镜下观察分析。选择信号清晰、强度均一且单一无重叠的细胞进行计数。正常判读标准：GLP13/GLP21组红绿荧光信号均为2个；18/X/Y组有2个天蓝色荧光信号，红绿荧光信号各1个或2个绿色荧光信号且无红色荧光信号。

将15 ml羊水离心弃上清，收集羊水细胞接种于羊水培养基中，放入二氧化碳培养箱，选用有透气孔的培养瓶贴壁培养。3 d后使用相差显微镜观察贴壁细胞生长状况，视细胞生长情况换液。所有步骤均严格执行无菌操作。培养7-14 d，当细胞生长旺盛，克隆数足够时，加入秋水仙素0.4-0.8 μg/ml停止培养，4 h后进行细胞学处理。常规制片，G显带，于OLYMPUS BX53光学显微镜下观察分析。每例样本至少观察并计数30个分裂相，分析6个核型，如有异常，则增加观察计数和分析的分裂相数量。

247例羊水样本中，除2例血性样本无法进行该检测以外，其余245例样本均在24-48 h内获得清晰的杂交信号，并成功分析出结果，诊断成功率99.19%；染色体数目正常185例，共检出60例异常结果。其中13号染色体数目异常1例、18号染色体数目异常15例、21号染色体数目异常30例、21号染色体二倍体和三倍体嵌合体4例、性染色体数目异常9例，X染色体单体、二倍体嵌合体1例。

247例羊水送检核型分析，6例羊水初次培养失败，其中1例孕妇重新抽取羊水并培养成功，241例样本均在3-4周内获细胞遗传学诊断，初次培养诊断成功率97.57%，再次培养诊断成功率97.98%。共检出66例异常核型。其中13号染色体数目异常1例、18号染色体数目异常15例、21号染色体数目异常30例、21号染色体二倍体和三倍体嵌合体4例、性染色体数目异常9例，X染色体单体、二倍体嵌合体1例，染色体平衡易位2例，倒位2例，染色体多态性2例。染色体数目正常的185例与FISH检测结果完全一致(185例)，符合率为100%。染色体数目异常的55例，与FISH检测结果也完全相符，符合率为100%。6例染色体结构异常，FISH检测无法检出。FISH结果和染色体核型分析结果比对情况见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 FISH结果和染色体核型分析结果比对 比对项目 FISH检测结果(n) 染色体核型分析结果(n) FISH检测结果与核型分析结果符合率(%) 异常结果数目 60 66 90.91 染色体数目正常的样本数 185 185 100 染色体数目异常结果的数量 60 60 100 染色体结构异常结果的数量 0 6 -* 13号染色体数目异常 1 1 100 18号染色体数目异常 15 15 100 21号染色体数目异常 30 30 100 21号染色体二倍体和三倍体嵌合体 4 4 100 性染色体数目异常 9 9 100 X染色体单体、二倍体嵌合体 1 1 100 染色体平衡易位 0 2 -* 染色体倒位 0 2 -* 染色体多态性 0 2 -* *:未检出

表 1 FISH结果和染色体核型分析结果比对

染色体核型分析初次诊断成功率为97.57%，FISH检测诊断成功率为99.19%，较核型分析诊断成功率更高；FISH检测在13号、18号、21号染色体以及性染色体数目的结果与核型分析完全一致，符合率为100%；FISH检测无法检出任何染色体结构异常，核型分析能够检出各种染色体结构异常。

培养细胞的羊水染色体核型分析能检出99.5%^[1]以上的胎儿染色体非整倍体异常和重排，但羊水核型分析必须要经过10-20 d的羊水细胞培养才能进行结果分析。在等待结果期间，孕妇及其家属会有极大的焦虑情绪和心理压力。同时，羊水细胞培养对孕周的要求较高，一般为孕18-22周，有文献报道超过24周羊水培养失败率增加^[2]。而且羊水细胞培养容易污染，操作繁琐，对实验室条件和实验人员技术要求较高，这使得染色体核型分析技术在产前诊断中的应用受限。

FISH检测技术与羊水细胞培养的核型分析相比，无培养失败的风险，且能够快速做出初步遗传学诊断。FISH检测一般可在48 h内发出报告，大大缩短了传统染色体核型分析的报告时间，对于缓解孕妇及其家属焦虑的情绪大有裨益，尤其对于排查染色体数目异常的胎儿更加具有现实意义。并且，FISH检测不受孕周的限制，不需要对细胞进行培养，组织是否污染对结果亦无影响，大大提高了诊断效率。同时，FISH检测所需羊水量少，本实验中仅为5 ml，而核型分析为了保证细胞培养成功，至少需要15 ml。FISH技术的这些特点都确保了诊断的成功率。

FISH技术诊断胎儿常见染色非整倍体具有速度快、准确性高等优点，但是也存在一些缺点。受试剂盒探针的限制，不能对13、18、21、X和Y这5条染色体以外的其他染色体数目异常的检测；也无法检出染色体结构异常；对于特殊的核型，如易位型21-三体，检出率低，仅使用FISH检测易漏检^[3]，需配合其他手段进行联合诊断。

FISH技术的基本原理是利用核酸碱基互补配对的特性，用荧光素标记DNA或者RNA探针使之与靶序列结合，在荧光显微镜下观察靶序列在染色体或基因组中的分布情况和相对位置^[4]，被广泛应用于基因定位、核型分析、基因组进化、物理图谱构建、转基因生物的鉴定等领域。通过不断改进靶标序列和探针种类，FISH检测技术的分辨率和灵敏度也在不断提高。近年来FISH技术与物理、化学、生物等多学科多技术手段结合，衍生出免疫-荧光原位杂交技术、量子点-荧光原位杂交技术、微流控芯片-荧光原位杂交技术等。在细胞遗传学、表观遗传学及分子生物学等多种领域具有极大的应用价值，为基因组研究提供了强大的技术支持。FISH技术目前常用于快速产前诊断、病原微生物诊断、重复序列与染色体分带、端粒序列的定位、基因图谱绘制等。

本研究主要讨论FISH技术在快速产前诊断中的应用。染色体异常是导致习惯性流产和新生儿出生缺陷的常见病因，我国每年由于染色体异常导致出生缺陷的新生儿约10万人，新生活婴中染色体异常者约占0.5%^[5]。由于染色体异常目前尚无有效治疗方法，新生儿出生缺陷给家庭和社会带来巨大的负担。因此，细胞遗传学分析应用于产前诊断具有极其重要的现实意义。在本研究中，245例孕妇进行羊水产前诊断，胎儿染色体异常率为26.94%，显著高于一般人群染色体异常发生率0.6%^[6-8]。本研究通过FISH技术快速产前诊断245份羊水，并与传统羊水细胞核型分析进行对比。结果FISH成功检出60例异常核型，培养细胞的羊水染色体核型分析共检出66例异常核型，结果符合率90.91%，漏诊率9.09%，13号、18号、21号、X和Y染色体数目异常结果符合率100%，未发生误诊情况。有文献报道FISH检测的敏感度、特异度以及与核型分析的符合率均大于99%^[9-11]，与本研究结果相似，这表明FISH技术作为一种可靠的快速产前诊断技术可以广泛地被应用于临床。

综上所述，FISH技术在产前诊断中不受孕周的限制，是一种快速的检测手段，也可以作为羊水培养失败的补救措施，广泛应用于孕晚期高危孕妇的产前诊断。但FISH检测由于受到可制备的探针种类的限制，只能检测特定的染色体数目异常和微小结构缺失、重复，不能完全取代羊水核型分析。尽管如此，FISH检测仍不失为一种好的快速产前诊断方法，具有极其广阔的应用前景，给临床提供了更多一种选择。