哺乳动物的精子发生过程极其复杂，该过程受多种因素如激素、转录因子、染色质相关因子等调控^[1]。随着小鼠基因敲除小鼠的广泛应用，最近研究发现越来越多的基因参与调节精子发生，其中精子相关抗原16 (sperm associated antigen 16, SPAG16)是其中一个重要基因。

SPAG16最初由本团队克隆，其衣藻同源基因PF20仅转录一个mRNA并翻译一个蛋白，该蛋白缺失可导致衣藻鞭毛运动障碍^[2]。而小鼠SPAG16基因表达2个转录子，其中全长的71 kU SPAG16L表达于运动纤毛中心管，组装精子鞭毛并调节其运动，小鼠缺失该蛋白表现为精子运动障碍所致的雄性不孕^[3]。35 kU的SPAG16S位于圆形精子核内，其氨基酸序列同SPAG16L的C端完全相同，小鼠缺失SPAG16S导致以鞭毛形成异常为主的精子发生障碍^{[4, 5]}，显示SPAG16S主要调节精子发生过程。SPAG16S蛋白有7个WD重复序列，该序列介导蛋白-蛋白相互作用。为进一步研究其调节精子发生的机制，我们用WD重复序列进行酵母双杂交筛选，发现BC022687为其结合蛋白。为了解该蛋白的功能，我们构建了BC022687的N端结合区的原核表达载体^[6]，纯化得到BC022687-pET28a融合蛋白。用此蛋白免疫新西兰兔，制备出了多克隆抗体，Western blot检测其能特异性识别BC022687融合蛋白，该抗体的成功制备为研究BC022687在精子发生中的功能奠定基础。

18-20 g雄性昆明小鼠由我校医学院胡霞敏教授实验室惠赠; 质粒pET28a、感受态大肠杆菌(E.coli. DH5α) BL21(DE3)购自TIAGEN公司; DNA marker、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒购自Fermentas公司; TA克隆试剂盒、SilverQuest^TM银染试剂盒、ECL试剂盒、RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司; T₄ DNA连接酶、BCA蛋白测定试剂盒购自北京碧云天公司; 琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、His tag单克隆抗体购自AXYGENE公司; DNA限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ购自NEB公司，IPTG为上海生物工程技术公司产品; 蛋白纯化采用QIAGEN的Ni-NTA Spin Kit完成。

根据GenBank中小鼠BC022687 mRNA序列设计RT-PCR特异性引物，其中上游引物序列为：5′-GCTAGCGGCTACACCAAGATGC AAGGC-3′; 下游引物序列为：5′-GAATTCCAGGAGTTCAAAAGACTGAGA-3′。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

采用TRIzol试剂从小鼠双侧睾丸组织中提取总RNA，逆转录成cDNA后进行PCR扩增，扩增条件为：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，70 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃末次延伸10 min，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，对目的片段进行胶回收。PCR回收产物在T₄ DNA连接酶作用下用pCR 2.1载体进行TA克隆，连接产物转化TOPO 10感受态细胞，氨苄抗性筛选，对阳性克隆进行EcoRⅠ单酶切及测序鉴定。

将鉴定正确的TA克隆质粒及原核表达载体pET-28a均以EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，胶回收、纯化后连接，连接产物转化到E.coli. DH5α感受态细胞，卡那抗性筛选，对阳性克隆进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。

将重组表达质粒BC022687/pET-28a转化到E.coli. BL21(DE3)感受态细胞，分别挑取单克隆菌落共2个接种于3 ml LB培养液(卡那霉素终浓度为50 μg/ml)中，37 ℃，280 r/min摇过夜，取菌悬液100 μl到3 ml LB培养液(卡那霉素终浓度为50 μg/ml)中，37 ℃，280 r/min摇1-2 h，检测OD₂₆₀值在0.4-0.6之间后，取其中2 ml加入4 μl 0.5M IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L)，剩余1 ml作为阴性对照，37 ℃，280 r/min摇3h，收集菌悬液，离心，裂解蛋白，15%的SDS-PAGE凝胶电泳，一部分用于考马斯亮蓝染色，一部分用于银染(银染步骤参照说明书进行)，另一部分用鼠抗His tag单克隆抗体进行Western blot检测，以确定表达蛋白是否为His Tag融合蛋白。

将重组表达质粒BC022687/pET-28a转化到E.coli. BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落接种于3 ml LB培养液(卡那霉素终浓度为50 μg/ml)中，37 ℃，280 r/min，摇3-4 h。取上一步每管菌悬液200 μl到含15 ml LB培养液(含75 μl卡那母液10 mg/ml)的50 ml离心管中，37 ℃，280 r/min，摇过夜。菌悬液15 ml转入250 ml LB培养液(卡那霉素终浓度为50 μg/ml)中，37 ℃，280 r/min，摇1.5 h，测OD₂₆₀值在0.4-0.6之间后，0.5 mol/L IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L)，37 ℃，280 r/min摇3-5 h，收集菌沉淀，用QIAGEN的Ni-NTA Spin试剂盒中的细菌裂解液Buffer B (7 mol/L Urea，100 mol/L NaH₂PO₄，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)裂解菌体释放蛋白，每500 ml菌沉淀加入20 ml Buffer B液，置冰上30 min; 4 ℃，12 000 r/min离心15 min收集上清。将上清低流速装入已预先用Buffer B活化的Poly-Prep色谱柱(Bio-Rad公司)，依次用100 mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)→0.5 mol/L NaOH→20%乙醇→双蒸水→100 mmol/L硫酸镍→双蒸水过柱洗脱; 用含有8 mol/L尿素的1×PBS缓冲液过柱平衡; 依次用含20 mmol/L→250 mmol/L→500 mmol/L→1 mol/L咪唑的洗脱液分段洗脱，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。

取800 μg纯化后的融合蛋白His6-BC022687与弗氏完全佐剂等体积混匀，充分乳化后，于兔背部皮下多点注射。初次免疫后每隔2周加强免疫1次。从第3次免疫开始，每次免疫前均抽取适量全血取血清进行抗体效价检测。经过4次加强免疫后符合要求，立即颈动脉采血，分离血清后，无菌分装保存于-80 ℃备用。以未诱导的和诱导的细菌BC022687总蛋白为样本，Spag16L-His/Tag作为对照，进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，样品一部分用于考马斯亮蓝染色，另一部分分别用鼠抗His/Tag单克隆抗体、Spag16抗体和本次制备的BC022687抗体进行Western Blot检测。

以小鼠睾丸组织提取的总RNA为模板，进行RT-PCR反应，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条约311 bp的清晰条带(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 小鼠睾丸组织Bc022687基因PCR扩增 S，样品; NC，阴性对照

将结果2.1中PCR产物TA克隆后，经EcoRⅠ单酶切鉴定，4个克隆均在约311 bp处有阳性条带，提示TA克隆成功，测序结果与琼脂糖电泳结果一致(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 BC022687质粒TA克隆鉴定 S1-S4，样品1-4; M1：1 kB marker; M2：100 bp marker

TA克隆产物通过连接、转化，亚克隆到pET-28a载体上，对重组表达质粒进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切及测序分析，证实BC022687插入pET-28a载体而且方向正确(图 3)，测序分析证实该插入片段即为311 bp的BC022687编码序列，与GenBank中小鼠BC022687的基因序列同源性为100%。

图 3(Figure 3)

图 3 BC022687/pET28a质粒双酶切鉴定 S1-S4，样品1-4; M1：1 KB marker; M2：100 bp marker

原核表达质粒BC022687/pET-28a转化入BL21(DE3)后，考马斯亮蓝染色及银染色结果均发现，经IPTG诱导后，2个单克隆均在约18.0 kU处出现一条明显的蛋白条带，其相对分子质量(M_T)与His6-BC022687融合蛋白的大小相符，而未诱导的样品未出现此条带(图 4a，b)。表达产物以鼠抗His tag单克隆抗体孵育，结果见图 4b，由图可见在18.0 kU处有与His tag单克隆抗体发生特异性反应的条带，表达结果与考马斯亮蓝染色结果一致。由此说明表达产物带有His6-BC022687的融合蛋白，将继续进行亲和层析步骤，纯化该融合蛋白。

图 4(Figure 4)

图 4 考马斯亮蓝染色和Westernblot分析BC022687蛋白表达 M，蛋白marker; S1，BC022687诱导前样品1; S2，BC022687 +IPTG诱导后样品1; S3，BC022687诱导前样品2; S4，BC022687+IPTG诱导后样品2

目的蛋白BC022687的N端融合有组氨酸标签(His6)，通过Ni²⁺-NTA亲和层析纯化His6-BC022687融合蛋白。在含250 mmol/L的咪唑洗脱缓冲液中，Ni²⁺-NTA与组氨酸标签的亲和力降低，融合蛋白被洗脱下来。纯化后，用120 g/L的SDS-PAGE在洗脱液中可检测出M_T为18.0 kU左右的蛋白(图 5)。经超滤浓缩、过滤除菌后得到纯化的重组蛋白，测定其蛋白总量为2.19 mg/ml。

图 5(Figure 5)

图 5 纯化的His6-BC022687融合蛋白的SDS-PAGE分析 a. M，marker; 1，N-BC022687诱导前; 2，N-BC022687诱导后; b. 1，N-BC022687柱前，20 μl; 2，N-BC022687流穿，20 μl; 3，N-BC022687，250 mmol/L咪唑缓冲液洗脱①; 4，N-BC022687，250 mmol/L咪唑缓冲液洗脱②; M，marker

考马斯亮蓝染色结果发现，经IPTG诱导后，BC022687-His/ Tag在约18 kU处出现一条明显的蛋白条带，其相对分子质量(M_T)与His6-BC022687融合蛋白的大小相符，而未诱导的样品未出现此条带，对照组Spag16L-His/Tag在约75 kU处出现一条明显的条带(图 6a)。Western blot检测结果显示，一抗为His/tag单克隆抗体时，BC022687-His/Tag与Spag16L-His/Tag分别在18 kU与75 kU位置出现蛋白条带，两种蛋白的M_T均正确，结果与考马斯亮蓝染色相符(图 6b)。Spag16抗体只识别Spag16L蛋白，本次制备的抗体只识别BC022687蛋白(图 6c，d)。

图 6(Figure 6)

图 6 Bc022687多克隆抗体的特异性检测

精子相关抗原(SPAG)是一组主要在睾丸/精子高度表达的蛋白。其中SPAG16是衣藻瘫痪鞭毛PF20的同源体^[7]。PF20在衣藻运动鞭毛轴突中心管表达，与另外两种蛋白PF16、PF6形成一个网络共同动态调节纤毛和鞭毛运动，缺失这三种蛋白的衣藻鞭毛中央微管结果异常，导致衣藻鞭毛运动麻痹^[8]。研究发现^[9]，哺乳动物的SPAG16蛋白不仅在于精子鞭毛形成有关的结构表达，且在形成原纤毛的小鼠成纤维细胞核肾内髓集合管上皮细胞中定位于调节纤毛形成的重要细胞器，提示该基因功能异常可能引起纤毛形成或功能障碍，但其机制有待于进一步阐明。

我们用SPAG16S的WD重复序列作为底物进行酵母双杂交筛选，发现BC022687蛋白可能与SPAG16蛋白相互作用^[4]。本团队前期研究发现^[10]，携带GFP基因的BC022687真核表达质粒转染CHO细胞中表达，不仅分布在细胞质中，更为重要的是它在中心体也有表达。中心体是纤毛形成过程中的一个重要结构，由母中心体来源的基体是纤毛形成的模板，因此推测BC022687可能参与纤毛形成调节。

本研究通过构建BC022687的原核表达质粒，诱导表达了His6-BC022687融合蛋白，并且对其进行了多克隆抗体的制备。His6-BC022687融合蛋白分子量应约为18 kU，以其为免疫原免疫新西兰兔，成功制备了抗Bc022687融合蛋白多克隆抗体，并对多克隆抗体进行特异性检测，Western Blot分析表明，制备的多克隆抗体可特异性识别重组表达的His6-BC022687融合蛋白。该抗体的获得对进一步研究BC022687的生物学特性，特别是在精子发生过程中的作用奠定了初步基础。