武汉大学学报(医学版)   2018, Vol. 39Issue (2): 283-286   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.8015.
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引用本文 

胡玲娟, 吴春江, 周旭炜, 刘燕婕. 全身型幼年特发性关节炎Th17/Treg细胞平衡改变的临床意义[J]. 武汉大学学报(医学版), 2018, 39(2): 283-286. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.8015.
HU Lingjuan, WU Chunjiang, ZHOU Xuwei, LIU Yanjie. Equilibrium of Th17/Treg in Children with Systemic-Onset Juvenile Idiopathic Arthritis[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2018, 39(2): 283-286. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.8015.

基金项目

国家自然科学基金资助项目(编号：21611130030);武汉市卫计委临床科研项目(编号：WJ2015XB004)

通讯作者

刘燕婕，女，1967-，医学博士，副主任技师，主要从事自身免疫临床诊断研究, E-mail: liuyangie0411@aliyun.com

文章历史

收稿日期：2016-11-05
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
全身型幼年特发性关节炎Th17/Treg细胞平衡改变的临床意义
胡玲娟 1, 吴春江 2, 周旭炜 2, 刘燕婕 2     
1. 湖北省卫生计生委综合监督局 湖北 武汉 430079;
2. 长江航运总医院/长航疾控中心 湖北 武汉 430010
收稿日期：2016-11-05
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：21611130030);武汉市卫计委临床科研项目(编号：WJ2015XB004)
通讯作者：刘燕婕，女，1967-，医学博士，副主任技师，主要从事自身免疫临床诊断研究, E-mail: liuyangie0411@aliyun.com
[摘要] 目的: 探讨Th17/Treg细胞平衡关系在全身型幼年特发性关节炎(SoJIA)发生、发展中的作用。方法: 采用流式细胞术(FCM)检测SoJIA患儿活动期、缓解期外周血Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的比例；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患儿血清细胞因子IL-17、IL-6和TGF-β1的表达水平，以健康儿童和化脓性关节炎患儿作正常和疾病对照组比较观察。结果: 活动期组患儿外周血Th17细胞比率为(3.73±1.55)%，明显高于健康儿童组、化脓性关节炎患儿组和缓解期组(P＜0.05)；活动期组、缓解期组患儿外周血Treg细胞比率分别为(3.49±1.73)%和(4.01±1.81)%，均低于健康儿童组和化脓性关节炎患儿组，但无统计学差异(P＞0.05)；活动期患儿组血清IL-17、IL-6含量分别为(14.01±5.63) ng/L和(10.56±4.67) ng/L，显著高于健康儿童组、化脓性关节炎患儿组和缓解期患儿组(P＜0.05)；活动期、缓解期组患儿血清TGF-β1水平分别为(221.30±43.77) ng/L和(210.60±39.12) ng/L，均高于健康儿童组和化脓性关节炎患儿组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；活动期、缓解期组患儿血清IL-17与IL-6表达水平呈正相关，分别为(r=0.238，P＜0.05;r=0.299，P＜0.05)，但TGF-β1与IL-17、IL-6表达水平无显著相关性。结论: SoJIA患儿体内存在Th17/Treg细胞失衡，且随疾病的活动和炎症缓解而趋于正常。Th17/Treg细胞失衡期，Th17细胞比率升高，Treg细胞比率降低，其相关细胞因子表达异常。
关键词：全身型幼年特发性关节炎    Th17/Treg细胞比率    细胞因子    
Equilibrium of Th17/Treg in Children with Systemic-Onset Juvenile Idiopathic Arthritis
HU Lingjuan1, WU Chunjiang2, ZHOU Xuwei2, LIU Yanjie2     
1. Health and Family Planning Commission of Hubei Province and Comprehensive Supervision, Wuhan 430079, China;
2. Dept. of Clinical Laboratory, General Hospital of The Yangtze River Shipping, & Center for Disease Prevention and Control of The Yangtze River Administration of Navigational Affairs, Wuhan 430010, China
[Abstract] Objective: To investigate the proportions of peripheral blood Th17/Treg cells and the serum level of related cytokines in children with system-onset juvenile idiopathic arthritis (SoJIA) and their clinical significance. Methods: The proportions of peripheral blood Th17/Treg cells in the active phase and remission phase of SoJIA patients, as well as pyogenic arthritis patients and healthy subjects were determined by flow cytometry (FCM). ELISA experiment was used to detect IL-17, IL-6 and TGF-β1 levels in the serum. Results: The proportions of Th17 cells over CD3+ CD8- were (3.73±1.55)% in active phase group. The difference among four groups was significant, and the active phase group had higher proportion of Th17 than the other three groups(P < 0.05). The ratios of CD4+ CD25+ Treg cells over CD3+ CD8- were (3.49±1.73)% and (4.01±1.81)% in active phase group and remission phase, respectively, which were reduced compared with those in pyogenic arthritis patients and healthy subjects. But the ratio of CD4+ CD25+ Treg cells over CD3+ CD8- cells between each group was not significantly different(P > 0.05). The serum IL-17 and IL-6 levels were (14.01±5.63) ng/L and (10.56±4.67) ng/L in active phase group, respectively. Compared with control group, the levels of IL-17 and IL-6 in the serum of active phase group and remission group were increased. There were significant difference between active phase group and control group (P < 0.05). The serum TGF-β1 levels were (221.3±43.77) ng/L in active phase group, which was higher than those in pyogenic arthritis patients and healthy subjects, but the difference among four groups was not significantly different(P > 0.05). IL-17 and IL-6 levels were positively correlated in active phase group and remission group. But there was no obvious correlation between TGF-β1 level and the levels of IL-17 and IL-6 in active phase group and remission group. Conclusion: Imbalance of Th17/Treg cells may play an important role in the occurrence and development of insystem-onset juvenile idiopathic arthritis. Abnormal secretion of cytokines may be associated with the activity and inflammatory reaction process of SoJIA disease.
Key words: System Onset Juvenile Idiopathic Arthritis    Th17/Treg Cells Ratio    Cytokines    

全身型幼年特发性关节炎(system onset juvenile idiopathic arthritis，SoJIA)是儿童时期以发热、关节炎、皮疹、浆膜炎等为主要临床表现的慢性炎症性疾病。发病率约占幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)患儿的10%[1, 2]。与其他JIA亚型相比，SoJIA诊断与治疗较为困难。目前SoJIA确切的病因和发病机制尚不明确。已知Th细胞亚群之间存在着微妙的调节关系，而Th17细胞与Treg细胞之间关系尤为密切。Th细胞在不同的细胞因子环境下，通过不同的信号途径使初始Th细胞向Th17和Treg细胞的分化进行调节, 并通过相关转录因子在分子水平介导Th17和Treg细胞的平衡。由于Th17细胞活化所分泌的细胞因子能引起机体免疫调节障碍，致使炎性细胞以及包含自身抗体在内所形成的免疫复合物等共同引起组织和器官的损伤，而Treg细胞能参与机体免疫负调控，在阻止自身免疫性疾病的发生和维持自身免疫耐受等方面具有重要功能。维持Th17与Treg细胞间的动态平衡，在机体免疫防御、免疫自稳中发挥重要作用。已有研究表明[3]，JIA患儿活动期Th17/Treg细胞失衡，Th17细胞增多。由此推测，Th17/Treg细胞平衡关系可能是SoJIA发生、发展的重要原因。

本研究分别采用流式细胞技术(FCM)和酶联免疫法(ELISA法)检测SoJIA患儿活动期、缓解期外周血Th17细胞和Treg细胞占CD4+T细胞的比例及血清细胞因子IL-17、IL-6，TGF-β1表达水平，并与健康儿童和化脓性关节炎患儿作对照观察，旨在分析Th17/Treg细胞比率失衡及相关细胞因子水平变化特点，辅助临床对SoJIA的诊断和疾病活动性判断，为进一步揭示SoJIA发病机制及诊治方案提供帮助。

1 材料与方法 1.1 研究对象

选择2010年1月-2013年12月在我院确诊的SoJIA患儿47例，男25例、女22例，年龄5.5-16(8.0±6.5)岁，病程0.5-2.5(1.65±1.2)年，其中活动期27例、缓解期20例为研究对象。诊断标准参照国际风湿病学联盟(ILRA)儿科专家组制定的诊断和分类标准讨论稿[4]：弛张高热至少2周以上，伴有关节炎，同时伴有以下1项或以上的症状：①间断出现、不固定的红斑样皮疹；②全身淋巴结肿大；③肝和/或脾肿大；④浆膜炎。活动期标准为：发热、受累关节肿痛或压痛，关节活动受限≥2，C-反应蛋白(CRP)>30 mg/L为辅助诊断指标。缓解期标准为：无发热、关节肿痛或不伴以压痛的关节活动受限＜2个、CRP＜30 mg/L、糖皮质激素用量≤1 mg/(kg·d)，且2个月内无疾病活动表现。选择同期化脓性关节炎患儿31例，男20例，女11，年龄6-16岁，平均(10.0±5.5)岁，病程0.5-1.5月，根据病史、临床症状、体征及实验室血、关节液细菌培养确诊。正常对照组：健康儿童29例，男18例、女11例，年龄5-15(5.5±6.0)岁，性别、年龄与SoJIA组匹配(P＞0.05)。

1.2 主要仪器与试剂

FCM检测抗体和试剂、FACScan流式细胞仪、CELLQUEST分析软件由美国Becton-Dickinson公司提供。ELISA检测分别用美国R&D Systems公司人IL-17和TGF-β1酶联免疫诊断试剂盒及比利时Innogentics公司人IL-6酶联免疫诊断试剂盒。全自动酶标仪为美国BIO-TEK公司生产的ELx800，全自动洗板机为美国伯乐生产的Bio-rad1575。

1.3 实验方法 1.3.1 Th17和Treg细胞检测

抽取受试者清晨空腹静脉抗凝血3-5 ml，充分混匀，立即处理血液标本。首先取未刺激肝素抗凝全血100 μl，加鼠抗人PerCP-抗CD3和FITC-抗CD4/PE-抗CD8抗体20 μl，4 ℃避光孵育30 min，加4 ml NH4Cl溶血剂溶血，PBS洗涤2次重悬上机检测。同时将肝素钠抗凝血与RPMI 1640培养液1:1比例混匀，37 ℃，CO2培养箱中培养4 h，收集细胞等分测定管和同型对照管，加PerCP-抗CD3抗体和FITC-抗CD8抗体，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，固定液室温避光反应15 min后弃去上清液，PBS洗涤2次，加入破膜剂和FE标记抗人IL-17A单抗进行细胞内染色，最后经PBS洗涤2次后，上机检测。然后以肝素抗凝血加入PerCP标记的CD4单克隆抗体和FITC标记的CD25为测定管，同时设立同型对照管进行检测。FCM按常规操作进行，根据正向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，分别测定Th17细胞和Treg细胞占CD4+T细胞的比例。

1.3.2 细胞因子IL-17、IL-6和TGF-β1含量检测

抽取受试者清晨空腹静脉血3-5 ml，离心分离血清冻存于-20 ℃冰箱待测。ELISA法作血清细胞因子检测，操作严格按试剂盒说明书步骤进行。

1.4 统计学分析

实验数据处理使用SPSS 15.0统计软件包进行分析。首先进行正态分布检验，符合正态分布以x±s和百分比和率表示，两组间比较用t检验，多组间采用单因素方差分析比较。非正态分布采用中位数和四分位数方法表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SoJIA患儿外周血Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的比例

活动期患儿外周血Th17细胞比率明显高于健康儿童组、化脓性关节炎患儿组和缓解期组(P＜0.05)，缓解期组Th17细胞比率高于健康对照组和化脓性关节炎患儿组，但无统计学差异(P＞0.05)；活动期组、缓解期组患儿外周血Treg细胞比率均低于健康儿童组和化脓性关节炎患儿组，但无统计学差异(P＞0.05)见表 1。

表 1 各组Th17、Treg细胞占CD4+T细胞比率(x±s)
2.2 SoJIA患儿血清细胞因子含量

活动期患儿血清IL-17、IL-6含量显著高于健康儿童组、化脓性关节炎患儿组和缓解期患儿组(P＜0.05)，缓解期患儿组血清IL-17、IL-6含量高于正常对照组和化脓性关节炎患儿组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。

表 2 SoJIA患儿血清细胞因子含量(x±s)
2.3 SoJIA患儿血清细胞因子间相关性分析

活动期、缓解期组患儿血清IL-17与IL-6表达水平呈正相关，分别为(r=0.238，P＜0.05；r=0.299，P＜0.05)，但TGF-β1与IL-17、IL-6表达水平无显著相关性。

3 讨论

SoJIA是JIA中具有独特临床特征的一种类型，常伴有急性炎性反应，部分患儿可并发巨噬细胞活化综合征(macrophage activation syndrome，MAS)，造成全身多器官损伤，病死率高，预后差[5]。SoJIA患儿存在免疫功能异常，但其病因和发病机制尚未阐明。近期研究表明[6-8]Th17和Treg细胞及Th17/Treg细胞平衡失调在多种自身免疫疾病发生中起重要作用。Th17细胞主要靠分泌IL-17、IL-6及IL-21等细胞因子发挥炎性效应，IL-17A尚和其他炎症细胞因子如TGF-β1、TNF-α共同诱导其他具有炎性活性的基因表达，引起炎症细胞浸润和组织损伤。而Treg细胞是“主动”地抑制自身反应性T细胞免疫反应的细胞，具有免疫无能性和免疫抑制性两大特性，对自身抗原和非己抗原均有较强的免疫抑制作用。亦有研究证实[9]Th17/Treg细胞失衡与JIA的发生相关，Th17/Treg细胞平衡失调及相关细胞因子改变还与JIA患儿关节损害有关。其中Th17及相关细胞因子IL-17在JIA中起到介导T细胞激活和骨吸收的作用；Treg细胞在JIA发生过程中起抑制作用，其发挥方式与免疫应答的强度、部位以及所处环境中的细胞因子种类等因素有关。该研究还发现JIA患儿关节滑液中的Th17明显升高，Treg细胞明显降低，血浆IL-17水平在活动期少关节型和多关节型JIA患儿中增高，与健康对照组比较有显著差异，外周血Treg细胞明显低于正常对照人群。由此可见，Th17/Treg细胞平衡改变参与JIA发生以及患儿关节炎发病的起始和骨组织破坏等至关重要阶段。我们研究发现SoJIA患儿活动期外周血Th17细胞比率明显高于健康对照组、化脓性关节炎患儿组和SoJIA患儿缓解期以及(P＜0.05)；SoJIA患儿外周血Treg细胞比率呈降低趋势，但与健康对照组和化脓性关节炎患儿组无显著差异(P＞0.05)；SoJIA患儿活动期血清IL-17、IL-6含量显著高于健康对照组和SoJIA患儿缓解期以及化脓性关节炎患儿组(P＜0.05)；SoJIA患儿TGF-β1水平呈增高趋势，但与健康对照组和化脓性关节炎患儿组无显著差异；SoJIA患儿IL-17与IL-6表达水平呈正相关，TGF-β1与IL-17、TGF-β1与IL-6表达水平无显著相关性。与上述文献报道结果基本相符。

目前对SoJIA患儿Th17和Treg细胞及Th17/Treg共同作用机制研究较少，本研究结果显示：SoJIA患儿外周血Th17细胞比率增高，Treg细胞比率降低，尤其疾病活动期Th17/Treg明显失衡，向Th17细胞方向偏移。本研究提示Th17与Treg细胞之间的免疫失衡在SoJIA，尤其是疾病的活动期的免疫病理中可能发挥重要的作用，分析Th17/Treg细胞比率及细胞因子改变，对SOJIA的诊断、疾病活动性判断和治疗方案的选择有重要的临床意义。

参考文献
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