据全球癌症统计报告，肺癌尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)在癌症患者中最为常见。非小细胞肺癌(NSCLC)占据肺癌患者的85%，还有少部分肺癌患者是小细胞肺癌(SCLC)，其中约一半的患者在限制性疾病和延长性疾病中被确诊。血清肿瘤标志物被认为是肺癌诊断的有效手段，越来越多的证据表明肿瘤标记物可以提供非小细胞肺癌患者的预后信息。肿瘤标志物是由肿瘤相关基因异常表达而产生的特异性大分子物质，这些物质分布在组织、体液和血液中。血清肿瘤标志物作为诊断工具，具有创伤小、检测迅速等优点，被广泛应用于恶性肿瘤诊断^[1]。

1 肺癌肿瘤标志物

肿瘤标志物主要有五种应用：筛选、监测疾病的进展、预后指标、检测复发、诊断工具^[2]。肺癌肿瘤标志物主要分为核酸类、蛋白类、外泌体三大类。癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CA-125、鳞状细胞癌抗原(SCC)，都是临床研究常用的蛋白类肺癌肿瘤标志物，均已表现出了重要的诊断价值和潜在的预后指标，也有助于系统治疗的监控。然而，在对肺癌患者进行诊断时只检测一种蛋白类肿瘤标志物很难得到最佳结果，其灵敏度较低且特异性较差。癌胚抗原、细胞角蛋白19片段和神经元特异性烯醇化酶是EGTM(欧洲肿瘤标志物组织)建议的肺癌标志物。对肺癌患者同时检测CEA、CYFRA21-1、NSE这3种血清标志物，可以使其诊断的灵敏度和特异性得到显著的增强。同时测量多种肿瘤标志物对监测癌症患者的临床病程以及辅助肺癌的诊断具有重要的临床价值。虽然NACB(美国临床生物化学学会)将proGRP也列为小细胞肺癌标志物之一，但血清proGRP医学决定水平较低(40或100 pg/mL)，检测结果稳定性有待提高。以癌胚抗原、细胞角蛋白19片段、神经元特异性烯醇化酶作为肺癌血清标志物基本能满足NSCLC和小细胞肺癌(SCLC)的辅助诊断、治疗监测和预后的需要。

1.1 癌胚抗原(CEA)

CEA是肿瘤细胞表面的抗原，是一种酸性糖蛋白，分子量为180×10³。CEA具有抗原特异性，显著显示上皮细胞选择性表达。CEA的亚群与细胞膜相关联，无论是在正常组织中还是在癌变组织中，CEA的表达形式都相当复杂。CEA在肺癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、类癌、肝癌等多种肿瘤组织中呈上升趋势^[3]。血清CEA水平的检测对非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、甲状腺髓样癌的诊断具有辅助价值，也有助于更好的预后评估。CEA是一种广谱肿瘤标志物，是非小细胞肺癌患者中应用最广泛的肿瘤标志物，对非小细胞肺癌和小细胞肺癌的敏感度为95%。与恶性肿瘤患者如肺癌和结直肠癌患者相比，健康人的血清中CEA的含量较低^[4]。

1.2 细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)

Cyfra21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，是一种酸性多肽，分子量为40×10³，主要分布在肿瘤上皮细胞中，可作为上皮性肿瘤标记物，对于辅助诊断非小细胞肺癌可以达到较理想水平。CYFRA21-1是一个敏感的肺癌肿瘤标志物，与非小细胞肺癌患者预后阶段显著相关，能够反映疾病的严重程度，在多变异分析中可以作为显著的预后因子^[5]，应用价值较高。

血清中CYFRA21-1的增加不仅是作为一种细胞溶解或细胞坏死后释放细胞角蛋白的结果，而且是在肿瘤细胞中通过活性蛋白酶使得细胞角蛋白降解的结果。Wang^[6]等研究显示，肺鳞状细胞癌患者血清中细胞角蛋白19片段水平明显高于肺腺癌患者和SCLC。Holdenrieder^[7]等经研究证实，Cyfra21-1不仅对非小细胞肺癌具有诊断、预测和预后价值，还被视为许多实体肿瘤的标志物。Li^[8]等研究表明CYFRA21-1对预测肺癌患者肿瘤转移和预后不良具有重要作用。

1.3 神经元特异性烯醇化酶(NSE)

NSE是烯醇化酶的同工酶，分子量约为87×10³。在小细胞肺癌(SCLC)中，NSE既是神经母细胞瘤的肿瘤标志物，也是目前小细胞肺癌诊断的重要血清标志物^[9]。因此，NSE是SCLC的首选肿瘤标志物。据报道，小细胞肺癌患者血清中NSE的含量显著升高，在NSCLC血清中也有所增加^[10-11]。血清中NSE的浓度与疾病进展有很大的相关性，NSE的较高预处理水平是肿瘤扩大和预后不良的指标之一。NSE是神经内分泌肿瘤的主要标志物，也是神经元和外周神经内分泌细胞的特异性标记物。正常情况下，在特定组织体液中NSE水平的增加会伴有恶性增生，从而对相关神经内分泌肿瘤的诊断和治疗是有价值的^[12]。NSE不仅适用于检测SCLC，还能够对SCLC放疗或化疗后的结果做出评价。

2 肿瘤标志物检测方法 2.1 放射免疫分析

放射免疫分析是由美国科学家Solomon A.Berson和Rosalyn S.Yalow于20世纪50年代后期创建的。放射免疫分析的创建在生物核素法的应用历史中具有里程碑式意义^[13]。放射免疫分析基于标记抗原和未标记抗原相互竞争特异性抗体结合位点，形成抗原抗体复合物，根据该复合物放射性强度的变化得出未标记的抗原量。

随着放射免疫分析技术的发展，基于使用抗体共价连接到聚合物包覆氧化铁的固相放射免疫分析系统被开发出来。Nye^[14]等在进行孵育试验过程中，使用电磁铁将颗粒混合，(通过开关)分离出抗体的结合和游离部分。这样可以避免耗费时间的垂直旋转和多次离心的需要以及传统的固相程序。固相放射免疫分析系统具有普遍适用性，已经被广泛应用于甲状腺素、人胎盘催乳素和地高辛的测定。

无论是对疾病的诊断还是对治疗的监测，就灵敏度、精确度、适用性以及操作简单性而言，放射免疫测定技术优于大多数同类分析方法。放射免疫测定技术极大地促进了内分泌生理学研究，且在临床化学中有广阔的应用前景，例如可应用于生物设计、药理学、毒理学和新药的药代动力学等领域^[15]。

2.2 酶联免疫分析

酶联免疫分析(ELISA)是荷兰科学家Van Weeman等于1971年发明的一项对抗体或附着于固相孔板中的抗原进行简单而快速检测和定量的有效方法。该技术利用酶联抗体与表面附着抗原结合，随后添加酶作用物以产生与原始样品中存在的抗原量相关的颜色变化或光信号，根据待测物的浓度与颜色深浅的变化呈正相关得出相应的结果^[16]。

ELISA具有快速、灵敏度高、易操作等优点，作为最灵敏的免疫检测分析技术之一，在实验室研究、疾病标志物的诊断和各个行业的质量监控等方面具有广泛应用。Padige^[17]等基于酶联免疫分析法对HDAC活性的测定将有助于亚型选择性HDAC抑制剂对哺乳动物细胞HDAC蛋白的鉴定。HDAC蛋白是治疗癌症的理想靶点，临床上使用的几种HDAC抑制剂都是抗癌药物。由于HDAC抑制剂的非特异性相互作用于组蛋白乙酰化过程，因而许多HDAC亚型能够应用于临床治疗。异构体选择性HDAC抑制剂成为剖析HDAC蛋白在肿瘤形成中的独特功能的有效工具，还有可能显示有效的抗癌特性。这将进一步增强以HDAC为中心的癌症研究，并为抗癌药物的开发提供基础。

食品科学及植物工程领域也经常使用酶联免疫分析试验来检测基因修饰、毒素或过敏原的存在。

2.3 化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(CLIA)是由化学发光系统与免疫反应系统相互结合形成的，是全球一致承认的较为先进的标记免疫分析技术。其原理为：被具有化学发光性能的物质所标记的抗体(抗原)与待测的抗原(抗体)发生特异性结合，伴随着呈现游离状态的化学发光物与该体系中的其他物质发生化学反应从而产生光，待测抗原(抗体)可以依据光强度得出相应的结果。

CLIA的优势在于其具有较高的灵敏度(可达到10~22 mol/L)，而放射免疫分析的灵敏度仅为10~12 mol/L。Li^[18]等同时采用ELISA和CLIA两种技术，以梅毒螺旋体特异性抗体作为检测对象。检测结果表明：与ELISA相比，CLIA能够更加可靠、灵敏、准确地检测血清梅毒螺旋体特异性抗体，在灵敏度上更具有竞争力。此外，CLIA还具有线性范围宽、光信号持续时间久、简单快捷、结果稳定以及安全性好等多种优势。目前，CLIA已经是至关重要的医学检测方法，被广泛应用于多方面的体外诊断试验中，如：机体免疫能力、肿瘤标志物、内分泌系统、传染病等。

2.4 蛋白质免疫印迹

蛋白质免疫印迹作为一种重要的、常规的蛋白质检测方法，应用于从复杂的样品中检测蛋白质，已超过了30年。虽然其成像和试剂技术在提高灵敏度、动态探测范围和复用目标检测的适用性方面取得了重大发展，但基本技术仍然保持不变。该技术通过凝胶电泳分离出蛋白质，将其转移到固相载体(如聚偏氟乙烯膜)上，对固定化抗原选择性免疫检测。蛋白质免疫印迹依赖于抗体—抗原相互作用的特异性，有助于从复杂混合物中定性或半定量地鉴定特定蛋白质及其分子量^[19]。该技术由于具有高选择性和稳定性、易于制备、成本低廉等优点^[20]，在制备人工抗体方面显示出巨大的应用潜力。

Hughes^[21]等开展了在纯电子控制下在单个玻璃微通道中进行的免疫印迹试验，采用微量蛋白印迹法对人血清(HIV免疫反应)和细胞裂解物(NFκb)进行了分析。该试验能够实现复杂混合物的检测，且耗时短，具有较高水平的质量灵敏度和高灵敏度50-pM检测限，定量能力动态范围为3.6-log。总之，实现快速定量免疫印迹分析是生命科学长期追求的目标。

2.5 微球悬浮阵列技术

微球悬浮阵列技术又称液相芯片技术，兴起于20世纪90年代后期，作为一种新型高通量检测技术，集微流技术、激光、信号系统以及化学技术于一体。液相芯片技术兼具芯片检测技术以及流式细胞术的优势，具有高灵敏度、高通量、可自动化以及较高特异性的良好性能。许多微流控芯片检测系统已被用于生物分析，如蛋白质组学、生物学、药学及临床研究等各个领域的高通量分析^[22]。例如，Zang^[23]等采用液相芯片质谱技术建立了在泌乳素腺瘤组织中溴麦角环肽的测定。该方法仅需20 mg(湿重)组织样品，总分析时长为6 min，定量分析的线性范围为50 fg/mg~5 pg/mg，并且检测限为25 fg/mg。该方法已成功用于定量测定在临床术后敏感和耐药的泌乳素腺瘤溴麦角环肽。结果显示溴麦角环肽在抗泌乳素腺瘤溴浓度(0.49~1.25 pg/mg)显著高于敏感的垂体泌乳素腺瘤(0.057~0.47 pg/mg)。这些结果证明液相芯片质谱技术同样适用于对少量的组织样本进行分析。目前，液相芯片技术正在逐步走向临床研究，其在蛋白质分析、药物筛选、疾病检测等方面具有广泛的应用前景，尤其是在临床应用领域具有很大的推广价值。

2.6 聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)诊断肿瘤细胞包括特定的染色体易位和嵌合基因融合产物^[24]。利用双标记、荧光、TaqMan探针，杂交目标重叠的嵌合基因融合，采用RT-PCR技术在细胞系和组织样本上进行检测。当每个肿瘤特异性探针和引物集用于不同的肿瘤和细胞系时，能够获得预期的特异性易位和嵌合基因融合。

循环肿瘤细胞的存在可能预示着疾病的复发和转移。经手术切除的Ⅰ期非小细胞肺癌患者的5年生存率仅为60%~70%，可能是因为未发现全身隐匿性微转移。而实时定量RT-PCR允许重复定量分析靶分子。D'Cunha^[25]等研究评估了定量RT-PCR检测隐匿性淋巴结癌胚抗原信使RNA作为肿瘤标志物的能力。他们对来自53例Ⅰ期患者(淋巴结阴性，根据组织学检查)的232例淋巴结进行了标准RT-PCR检测癌胚抗原信使核糖核酸。RT-PCR检测癌胚抗原与其检测Ⅰ期非小细胞肺癌患者隐匿转移率相似。这些发现表明聚合酶链反应可以从血液中低水平的非正常表达中鉴别出高水平的肿瘤特异性表达。通过聚合酶链反应技术检测癌细胞的mRNA是预测初期复发的可靠手段。

3 结语与展望

肺癌是目前全球和中国首位恶性肿瘤死亡原因。肺癌恶性程度高且预后不良，大概80%左右的患者会在确诊后一年内死亡，中位生存期约为半年时间，5年生存率只有5%~10%。对肺癌患者进行早期诊断能够显著提升肺癌病患的存活率。

血清蛋白标志物的检测能够达到早期肺癌辅助诊断的目的。而且，以血液为基础的生物标记物检测能够极大程度地减少患者的病痛。近年来，肿瘤标志物的检测方法发展迅速，预期未来检测手段将更加丰富、便捷、高效。