多糖是高分子化合物, 包括同多糖和杂多糖, 多由10个以上单糖构成的糖单位重复组成。多糖除了具有生活功能(如淀粉), 还有免疫调节^[1]、抗肿瘤^[2]、抗衰老^[3]、降血糖^[4]、降血脂^[5]等功能。为了便于在研究过程中使用荧光分光光度计、流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜等设备的检测, 将不携带光吸收基团的多糖进行荧光标记成为检测多糖的首要、关键技术难点。

荧光探针技术分析多糖灵敏度高、选择好, 在化学和生物的研究分析中广泛应用^[6-7], 目前已逐渐代替了放射性同位素标记方法。

荧光素类、罗丹明类、氰染料等是较为常见的荧光染料。其中, 荧光素类染料又包括异硫氰酸荧光素、羟基荧光素(FAM)等。这些染料可以与—OH、—SH、—NH₂等基团结合, 用于荧光探针检测和分析多糖。荧光素类染料标记的方法较稳定、效率高; 罗丹明类染料的活性部位可与待标记物的—NH₂结合, 常用的染料包括羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四乙基罗丹明(RB200)等, 其稳定性更好、标记效率更高; 氰染料在光照下不稳定, 但标记效率较高、光谱范围广, 主要包括香豆素类、哌洛宁类等染料。

目前, 异硫氰酸荧光素(FITC)的应用最为广泛。FITC分子量为389.4, 外观为橙黄色结晶粉末, 最大吸收光波长和最大发射波长范围分别为490~495 nm和520~530 nm, 其水和酒精溶液呈现明亮的易检测的黄绿色荧光, 且较易保存。国外对荧光标记多糖的研究报道中^[8-9], 尚未见对于这方面的较为系统的综述。本文收集、整理了FITC标记多糖的研究文献, 对相关研究进行了分析、比较, 总结了FITC标记多糖的研究进展, 在此基础上可以为后续有关多糖的生化研究提供方法学的依据。同时, 也为更好地开展多糖的应用研究提供有意义的参考。

1 FITC标记菌类多糖 1.1 FITC标记脂多糖

大肠杆菌的脂多糖(LPS)是免疫学中常用的B细胞促分裂因子, 也是生物实验中常用的多糖。龚建平等^[10]在Weersink等^[11]介绍的方法基础上探究了新的荧光标记方法。其实验过程是:先将LPS转化成单链状态, 再用FITC进行标记。这种标记方法简单并且是非放射性的, 具有较广泛的应用前景。得到的产物是FITC-LPS, 其与单核细胞的结合能力及促进TNF-α释放的能力与标准LPS无显著差异。Wang等^[12]则使用以下三种抑制剂:MDC(monodansylcadaverine)-网格蛋白的抑制剂、DS(dynasore)-发动蛋白的抑制剂、chloroquine-内吞抑制剂, 作用于巨噬细胞, 抑制FITC-LPS进入细胞。结果证明, FITC-LPS通过网格蛋白/发动蛋白介导的内吞作用进入细胞内, 并且这对激活TRAM-TRIF依赖的信号通路是必需的, 进一步证明荧光标记的重要性。

1.2 FITC标记酵母聚糖

酵母聚糖(zymosan)又称酵母多糖, 来自于酵母细胞壁, 是一种难溶解的碳水化合物。酵母聚糖有效成分β-葡聚糖是巨噬细胞激活因子。Thomton等^[13]为了证实β-葡聚糖通过定位在CD11b Ⅰ区域的外源凝集素位点与CR3(mac-1, CD11b/CD18)受体结合, 将10-kDa的可溶性酵母多糖(SZP)和FITC标记的产物SZP-FITC与NK细胞、单核细胞、中性白细胞等作用。结果表明, 白细胞CR3是酵母聚糖的受体。

1.3 FITC标记虫草多糖

冬虫夏草可以用于治疗肺结核、阳痿、盗汗和腰腿疼痛, 还具有降血糖的作用。其主要有效成分是虫草多糖, 虫草多糖可提高机体免疫能力, 在临床上已经用来治疗恶性肿瘤。唐惠玲等^[14]将FITC标记到虫草多糖上, 并研究表明分子量小、未硫酸化的多糖荧光标记效率更高。

1.4 FITC标记树舌多糖

树舌又称平盖灵芝、扁木灵芝, 具有抗肿瘤、免疫调节等作用, 还可以治疗风湿性肺结核。苏玲等^[15]将树舌灵芝液体深层发酵浸膏水提多糖(GAP)标记上FITC, 得到产物FITC-GAP, 研究FITC-GAP在人大肠癌细胞SWWC1116中的定位。荧光显微镜和流式细胞术的检测结果表明, FITC-GAP可与人大肠癌细胞SWWC1116的细胞膜结合并能转运到细胞核。GAP在SWWC1116细胞表面的特异性位点通过载体转运或细胞胞吞等方式进入细胞内。

1.5 FITC标记小刺猴头菌多糖和黑木耳多糖

小刺猴头菌是一种有药用价值的食用菌, 小刺猴头菌多糖是其重要的有效成分, 具有抗衰老、降血糖等功效。黑木耳能益气强身, 有治疗高血压、润滑肠道等功效。吴宗翰等^[16]利用氨化还原法将FITC标记到小刺猴头菌多糖和黑木耳多糖上, 研究其在生物体内的稳定性和代谢路径。结果表明, 小刺猴头菌多糖和黑木耳多糖在PBS、血浆和尿液中稳定性良好, 在体内24 h内稳定性良好。小刺猴头菌多糖在8 h内代谢完毕, 其代谢途径主要是经过消化系统。这为研究真菌多糖的药理活性提供了重要基础。

2 FITC标记海洋多糖 2.1 FITC标记褐藻多糖

硫酸多糖(911)是从褐藻中提取并经过化学修饰而得到的一种多糖, 具有增强机体免疫、抗病毒、抗凝血等功效。李福川等^[17]将Tyr的氨基与硫酸多糖911的还原性末端的半缩醛基连接, 具有了仲氨基的多糖可与FITC发生反应生成911-Tyr-FITC。结果表明, 标记后的硫酸多糖911无明显的细胞毒性, 对淋巴细胞有较强的选择性标记。

2.2 FITC标记海胆多糖

海胆具有滋补强身的功效, 其有效成分海胆多糖(SEP)更是具有免疫调节、抗肿瘤等作用, 所以研究海胆多糖在体内的稳定性具有十分重要的意义。康迪等^[18]用FITC标记海胆多糖得到产物FITC-SEP, 并探索其血浆代谢情况。结果表明, 通过大鼠尾静脉注射, 各种浓度的SEP血浆样品处理前或处理后在室温下放置6 h, 再在-20 ℃下冷冻, 融解后稳定性良好。

2.3 FITC标记硫酸化乌贼多糖

硫酸化乌贼多糖(SIP-SII)是从曼氏无针乌贼的墨汁中分离得到并经氯磺酸-甲酰胺法硫酸化修饰的酸性多糖, 具有免疫调节、抑制细胞迁移、诱导细胞凋亡等作用。蒋文洁^[19]用FITC标记硫酸化乌贼多糖, 研究其对EGFR/Akt/p38 MAPK信号通路介导的肿瘤迁移和侵袭的影响及机制。结果表明, SIP-SII主要与肿瘤细胞的细胞膜结合并可通过抑制膜上的EGFR(epidermal growth f-actor receptor)蛋白表达和活性抑制EGFR介导的PI3K/Akt/mTOR及p38MAPK信号通路, 从而起到抗肿瘤转移的作用, 这为EGFR靶向药物合用药的开发提供了理论依据。

3 FITC标记壳聚糖

壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰作用得到的, 具有降血脂、降血糖等功效。王月慧等^[20]采用FITC标记3种相对分子质量不同的壳聚糖, 体外研究发现FITC标记的壳聚糖仍然有抑菌活性, 但由于活性基团氨基被FITC占据, FITC标记后的壳聚糖抑菌活性明显降低。胡锦珍等^[21]则用FITC标记壳聚糖并给小鼠灌胃, 发现其浓度在血清中很低, 主要分布于肾脏, 部分分解的壳聚糖经尿液排出, 而多数壳聚糖以粪便形式排出。为了研究大鼠体内药代动力学, 吕志华等^[22]从甲壳质中提取并加工修饰得到硫酸氨基多糖PS916。PS916具有抗脂质过氧化、抗动脉粥样硬化等作用。研究表明, PS916的氨基可与FITC的异硫氰基发生偶联反应生成反应物PS916-FITC, 而PS916-FITC在大鼠体内的代谢、组织分布及排泄过程的研究可为临床研究和新药开发提供重要依据。

4 FITC标记植物多糖 4.1 FITC标记红毛无加多糖

红毛五加具有祛风湿、强筋健骨等功效。郝慧慧等^[23]从红毛五加中提取分离的多糖(AHP-Ⅱ), 可以提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力, 并促进白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-ɑ)和NO的释放, 具有很好的免疫调节作用。陈永等^[24]利用氨化还原法对红毛五加多糖AHP-Ⅱ的还原性末端进行选择性荧光标记, 研究AHP-Ⅱ与小鼠腹腔巨噬细胞结合情况。研究表明, AHP-Ⅱ可与小鼠腹腔巨噬细胞的细胞膜结合。这为后期研究AHP-Ⅱ在细胞内的免疫调节机制提供了重要参考。

4.2 FITC标记枸杞多糖

枸杞是我国传统的中草药, 其主要活性成分枸杞多糖(LBP)具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射等作用。陈忱等^[25]利用LBP的氨基与FITC异硫氰基结合反应的原理成功得到产物LBP-FITC, 且通过体外实验证明其在PBS、血浆和尿液中24 h内稳定性良好。这为LBP体内代谢研究提供了理论基础。

4.3 FITC标记黄芪多糖

黄芪来自于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根, 具有免疫调节、抗疲劳、保肝保心、调血压、抗肿瘤等十分广泛的作用。黄芪多糖(APS)^[26]是其重要的活性成分。由于分子量为10 000~50 000, 而大分子不利于口服剂吸收, 陈小云等^[27]使用氨化还原法将FITC标记到黄芪多糖上, 探究Caco-2细胞吸收黄芪多糖的情况。该实验成功地将FITC标记到黄芪多糖上, 生成产物Aps-Tyr-FITC, 并证明低浓度的壳聚糖和鱼精蛋白对Caco-2细胞吸收黄芪多糖有促进作用。

4.4 FITC标记麦冬多糖

麦冬的小块根是能够治疗肺燥干咳的中药, 对心脑血管的预防和降低血糖、调节心率等也有一定功效。谢华通等^[28]用FITC标记麦冬多糖MDG-1, 并观察其含量在大鼠胃肠道内的变化, 结果表明, MDG-1的主要代谢部位在肠道, 在胃内不分解。

4.5 FITC标记当归多糖

当归具有免疫、抗癌、抗衰老、补血、止痛等功效。当归多糖(ASP)是当归根的主要活性成分, 具有免疫调节、抗肿瘤等活性。罗立等^[29]将FITC标记到当归多糖上, 建立了当归多糖ASP1柱前荧光标记衍生和HPLC-FD(荧光高效液相色谱)法测定大鼠组织样品中当归多糖ASP1含量的方法。

4.6 FITC标记灰树花多糖

灰树花多糖(GRN)具有抗肿瘤和免疫调节等多种功效, 可与临床化疗药物联合使用。丁涛^[30]用FITC标记灰树花多糖, 研究Caco-2细胞对其吸收转运的机制。根据Caco-2细胞模型对GRN-Tyr-FITC的吸收情况, 推测GRN的口服利用率为20%~70%, 且在肠道内的吸收包括被动扩散和主动运输两种方式。

4.7 FITC标记松花粉多糖

松花粉来自于松科植物马尾松等同属数种植物, 可以增强机体的抗氧化活性和抗衰老能力、降血糖、保护心脑血管等。松花粉多糖(PPM60)是其重要的有效成分^[31]。FITC标记PPM60后的产物为PPM60-Tyr-FITC。实验证明^[9], PPM60-Tyr-FITC可与巨噬细胞表面的TLR4结合, 并且PPM60-Tyr-FITC可以经过内吞作用进入细胞。这对研究多糖在细胞内的定位及代谢机制有重要意义。

5 结语

近年, 多糖的免疫调节、美容保健等功能的研究日益广泛, 因而对多糖吸收代谢的研究, 以及在此基础上深入研究多糖调节机体的机制, 具有十分重要的意义。荧光素示踪定位多糖为深入研究多糖的结构及代谢机制提供了可靠的手段。我国的中医药文化博大精深, 多糖类天然产物或植物化合物也成为新型药物的来源。有效的荧光标记技术应用于多糖的代谢机理研究也为多糖的药物开发及临床应用提供了可能和帮助。

目前多数多糖定位研究的不足在于, 虽然定位了多糖在代谢中的位置, 但对代谢过程具体机制的研究还不够深入。例如, 多糖与细胞的作用是经过受体介导的^{[9, 12]}, 但受体与多糖具体的作用机制及之后细胞内信号转导途径引发的调控, 仍待进一步在改善多糖标记技术的基础上开展深入的研究。因此, 荧光标记应用于多糖的代谢研究具有潜在、重要的理论研究价值。