沙门氏菌是传播广泛且极具危害的食源性致病菌。在全球范围内, 每年沙门氏菌感染造成约1.15亿人患病和约37万人死亡。在我国细菌性食物中毒中, 有70%~80%是由沙门氏菌引起的^[1]。肠炎沙门氏菌感染成年宿主时常常表现为隐性, 临床症状不明显, 但沙门氏菌能长期定植于肠道和生殖道中并长期排菌, 成为重要的传染源^[2]。沙门氏菌是公共卫生和食品安全重要的防控对象。

沙门菌属包括两个种：肠道沙门菌(Salmonella enterica)和邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)。其中肠道沙门氏菌又分为六个亚种：肠道亚种、萨拉姆亚种、亚利桑那亚种、双相亚利桑那亚种、尹迪卡沙门氏菌和浩敦亚种。早期对沙门氏菌的分型以及命名是依据宿主、临床症状以及分离地区等差异来命名。例如, 依据沙门氏菌导致患者出现的伤寒症状命名了伤寒沙门氏菌(S.typhi)以及副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)；依据感染宿主不同命名了马流产沙门氏菌(S.abortusequi)以及羊沙门氏菌；依据分离地区命名了伦敦沙门氏菌(S.London)等一系列与地区相关的沙门氏菌。虽然早期的沙门氏菌命名没有体现生理学特征, 在出现生理生化反应后, 这种一个名代表一个种的命名方式迅速终止, 但新发现的肠炎亚种沙门氏菌仍沿用这种命名方法, 如1972年在上海分离的新沙门氏菌便命名为上海沙门氏菌(S.Shanghai), 而其它亚种的沙门氏菌采用其抗原式表示。目前由地区名字命名的沙门氏菌血清型有1475种^[3]。

血清型是沙门氏菌的重要表型之一, 是沙门氏菌致病性及溯源分析的重要依据。越来越多的血清型被发现, 血清型分析仍然是沙门氏菌研究不可或缺的项目。

结合国内外研究现状以及本实验室的研究进展, 本文对沙门氏菌的血清型及血清型分型技术进行综述。

1 沙门氏菌血清型研究进展

沙门氏菌血清型分型是一种表型分型方法, 是根据沙门氏菌菌体表面的抗原成分进行分型。沙门氏菌具有复杂的抗原结构, 包括菌体抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)、表面包膜抗原或荚膜抗原(Vi抗原)及其菌毛抗原四种。其中, O抗原与H抗原是进行血清型分型的最常用的两项指标, Vi抗原次之。

O抗原是由脂多(Lipopolysaccharides, LPS)成分构成, 由多个重复的寡糖单元链接而成, 分布于细胞外膜。O抗原的特异性来自脂多糖的多糖侧链部分^[4]。编码O抗原的基因包括rfb簇(菌体表面抗原合成基因)、wzx(O抗原转位酶编码基因)基因、wzy(O抗原聚合酶基因)基因。大多数O抗原基因具有高度特异性, 基因表达的调控机制复杂^[5]。造成O抗原多样性的主要原因在于：单糖种类及其空间排布的复杂性以及肽键的多样性。O抗原的主要功能是与沙门氏菌的入侵与定植、活体内存活、免疫逃避以及抵抗吞噬细胞等有关。沙门氏菌不只含有一种O抗原, 不同种的沙门氏菌含有的O抗原个数、种类不同。目前根据O抗原不同将沙门氏菌归类为A、B、C₁-C₄、D₁-D₃、E₁-E₄、G₁-G₂、H-Z和O₅₁-O₆₃以及O₆₅-O₆₇共计51个群。其中, 只有A-E群可导致人类患病^[6]。由于噬菌体的溶源化, 部分血清型的沙门氏菌会有两种O抗原表现形式。

H抗原是鞭毛蛋白, 由鞭毛素组成, 不耐热。鞭毛对沙门氏菌的运动、侵袭、定植以及生物被膜的形成发挥重大作用^[7]。现已发现114种H抗原, 大部分沙门氏菌会表达两种H抗原, 分别称为第一相、第二相, 这种沙门氏菌被称为双相菌；少数沙门氏菌仅含有单一相H抗原, 这种仅表达一项H抗原的沙门氏菌被称为单相菌。编码H抗原的相关基因为fliC(一相鞭毛)和fljB(二相鞭毛)^[8]。

Vi抗原是由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成, 性质不稳定, 加热到60℃或者石碳酸处理破坏Vi抗原。Vi抗原很罕见, 仅存在于伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。在进行O抗原血清凝集试验时, Vi抗原的存在会影响实验结果, 需要预先通过加热将Vi抗原破坏掉, 然后再进行O抗原凝集试验。

沙门氏菌的血清型表示方法是通过抗原式表示, 抗原式由三相组成, 依次是O抗原相、特异性H抗原相、非特异性H抗原相。沙门氏菌属血清型众多, 到目前为止已经发现了2610种血清型^[9]。

不同血清型的沙门氏菌具有相同或不同的宿主。依据宿主选择性的不同, 可将沙门氏菌分为两类：宿主适应性血清型和非宿主适应性血清型^[10]。前者包含的血清型对宿主的要求具有不同程度的选择性, 如马流产沙门氏菌、羊流产沙门氏菌、伤寒沙门氏菌等；后者对宿主具有广泛的选择性, 如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等。

2 血清型分型方法研究进展 2.1 玻片凝集反应

玻片凝集实验是在玻片上根据菌体与相应的单价血清反应是否出现凝集现象来判断沙门氏菌的抗原成分。沙门氏菌在进行玻片凝集试验前需要进行细菌的纯化、鉴定, 然后对O抗原、H抗原分别进行检测进行抗原检测时需要对沙门氏菌进行液体培养, 先进行自凝试验, 然后检测Vi抗原, 若与Vi抗原产生凝集则需加热破坏Vi抗原然后再进行O抗原检测。检测O抗原型时先用群血清O_A-F鉴定, 然后再用单因子血清鉴定。H抗原检测时需要对沙门氏菌进行H抗原诱导培养, 常用Swarm琼脂培养基平板, 检测H抗原型时同样先用H群血清鉴定, 然后再用其包含的单因子血清鉴定。沙门氏菌的血清型分析一般需要2-3天。

血清型分析仍然是沙门氏菌的基础分析项目。玻片凝集试验结果的判需要具有一定经验的技术人员。玻片凝集试验的分辨率低, 有时存在不凝集或交叉凝集现象。凝集试验需要消耗大量的血清试剂, 试剂昂贵且种类不全, 仅能检测较常见的血清型。玻片凝集分析耗时长, 鉴定O、H、Vi抗原型至少需要3天如果检测较少见的H抗原型, 则需要诱导H抗原生成, 耗时将成倍增加。在进化关系分析上, 血清分型并不能反映出遗传相关性。

2.2 抗体微阵列技术

抗体微阵列血清型测定方法是由Kauffmann-White提出, 该方法能够实现对O抗原和鞭毛H₁和H₂抗原的同时检测。最初建立的抗体微阵列使用35种抗体, 可以识别20种常见的沙门氏菌。该方法在检测前也需要对菌体鞭毛进行诱导生长。不同的是抗体微阵列检测不需要在固体平板上进行单菌落培养, 可以用培养的菌液进行检测。检测时需要对菌液灭活, 然后进行荧光抗体染色, 杂交反应后, 使用VersArrayhip Reader(Bio-Rad)扫描抗体—抗原结合反应的荧光信号。存在荧光信号被认为是相应的抗原型。Cai^[11]用该法在对117种不同血清型的沙门氏菌鉴定, 与玻片凝集试验的一致率为73.4%。

抗体微阵列血清型分析技术相对于传统血清分型技术的优点是能够同时检测O和H抗原, 减少了分析时间。该法具有较高灵敏度, 可以跳过反应转化阶段。但是该法没有实现所有血清型的检测, 扩大应用需要建立完善的检测体系。

2.3 通过全基因组信息或PCR扩增

随着分子生物技术的发展以及基因测序技术的普及, 细菌分子分型技术发展迅速, 逐步取代传统分型方法。但大多数的细菌分子分型方法的基础以及分型精度的参照还是以血清型分型为基础, 沙门氏菌的血清型分型方法仍发挥着至关重要的作用。

刘斌^[12]利用比较基因组的方法, 发掘出沙门氏菌血清组A-D沙门氏菌的特异PCR检测靶点, 通过建立的多重PCR检测体系可用于鉴定A-D血清组的菌株, 并通过实验对107株来自不同血清组的沙门氏菌分离株进行多重PCR检测, 检测结果与血清学鉴定结果一致。Echeita^[13]通过fliC和fljB基因设计的的10个多重PCR引物, 来检测沙门氏菌的139个H抗原。Mohd^[14]能够通过多重PCR对122株菌的O抗原、H抗原以及Vi抗原进行检测, 其中有94株(77%)菌检测结果与血清型一致。

随着全基因组测序时代的来临, 张少康^[15]通过编码沙门氏菌O抗原、H抗原以及Vi抗原的相关基因序列信息来预测确定血清型, 并通过网站：http://www.denglab.info/SeqSero, 对用户提交相关基因片段或者基因组序列预测出相关血清型。

PCR方法相较于玻片凝集检测血清型方法, 能够从分子层面对血清型进行检测, 可以通过测序后的序列信息来建立不同菌的系统发育关系。另外, 对某些难表达的H抗原检测, 该方法检测结果更具可靠性。

3 总结

随着基因组时代的来临, 分子分型技术(如MLST、cgMLST、wgMLST等)成为当前细菌分型研究的热点。但单纯的基因型研究似乎没有意义, 最后还要进行基因型与表型的关联研究。比如MLST分型产生的ST型与血清型具有极强的相关性^[16], 虽没有实现一个ST型代表一个血清型, 但是仅用七个基因便能实现这种分型精度, 并且以此建立起遗传关系, 具有很高的应用价值。如今还没有哪一种细菌分子分型方法能够实现“基因型—血清型的一一对应”关系, 血清型仍发挥不可替代的作用。基因分型研究将是未来的研究热点, 但是血清型分型不应被舍弃, 还应该作为一种基础检测项目, 在细菌鉴定、溯源分析中发挥作用。