碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)为复方钙补充剂，使用广泛，临床主要用于预防与治疗佝偻病、中老年骨质疏松^[3]，另有文献报道维生素D₃对老年高血压亦有协同治疗作用^[4]。因处方中维生素D₃含量较低，且为明胶包裹物，准确测定VD₃含量较为困难，当前样品处理方法主要有皂化法、提取后氮气吹干复溶法，但均存在操作过程复杂、准确度差的问题。本文方法采用一次萃取，萃取液离心后直接进样检测，操作便捷，准确度高。

1 实验部分 1.1 仪器与试药

安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1200 HPLC)；色谱柱：Phenomenex Luna (规格为：5 μm，4.6 mm×100 mm)。维生素D₃对照品(中国药品生物制品检定研究院，100061-201208，含量99.8%)；维生素D3粉(DSM Nutritional Products Ltd，含量100000U/g)；碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)(山东达因海洋生物制药股份有限公司，生产批号：130502)。正己烷、正戊醇、甲醇为色谱纯，二甲亚砜为分析纯。

1.2 色谱条件及系统适应性实验

以硅胶为填充剂，以正己烷/正戊醇(997:3) 为流动相，检测波长为265 nm，柱温30 ℃，流速1.5 mL/min，进样量100 μL。前维生素D₃与反式维生素D₃以及维生素D₃与速甾醇D₃的色谱峰分离度均应大于1.0^[10]。

系统实用性样品制备：量取维生素D₃对照品贮备溶液(Ⅰ)5 mL，置于棕色容量瓶中，于90 ℃水浴中加热1 h。取出后在冷水浴中放冷，加入5 mL正己烷，摇匀。取适量上述溶液，置于具塞石英吸收池中，使用波长分别为254 nm和365 nm的紫外光灯进行照射处理。照射时将石英吸收池倾斜约45°，距离灯管的距离为5~6 cm，照射时间约5 min，使维生素D₃部分转化成前维生素D₃、反式维生素D₃和速甾醇D₃。

1.3 供试品溶液制备

取样品20片，碾细，移至碘量瓶中，加入二甲亚砜/水(3:1) 的混合液30 mL及甲醇10 mL，超声约5 min。置于50 ℃水浴中，振摇5 min，取出后放冷至室温。精密加入正己烷25 mL，密塞，在室温下振摇20 min。倾取混合液适量至具塞离心瓶中，以3 000 rpm转速离心3 min。取上层正己烷液作为供试品溶液。

1.4 对照品贮备溶液制备

取对照品约12 mg，精密称定，移至100 mL棕色容量瓶中，加入适量的异辛烷，超声处理1 min。用异辛烷定容，摇匀，制得贮备溶液(Ⅰ)。精密量取5 mL贮备溶液(Ⅰ)，置于50 mL棕色容量瓶中，加入异辛烷稀释至刻度，摇匀，得贮备溶液(Ⅱ)。

1.5 响应因子测定

精密量取对照品贮备溶液(Ⅱ)5 mL，置于50 mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取100 μL，注入液相色谱仪，测定维生素D₃的响应因子f₁。

$ {f_1} = {c_1}/{A_1} $

式中：c₁为维生素D₃对照品溶液的浓度(μg/mL)；A₁为对照品溶液色谱图中维生素D₃的峰面积。

另精密量取对照品贮备溶液(Ⅱ)5 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加入少量2, 6-二叔丁基对甲酚(如2~3粒)，密塞，置于90 ℃水浴中加热1.5 h。取出后在冷水浴中冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。精密量取100 μL，注入液相色谱仪，计算前维生素D₃的响应因子f₂。

$ {f_2} = \left( {{c_1} - {f_1}{A_1}} \right)/{A_2} $

式中:c₁为维生素D₃对照品溶液的浓度(μg/mL)；f₁为维生素D₃的响应因子；A₁为混合对照品溶液色谱图中维生素D₃峰的峰面积；A₂为混合对照品溶液色谱图中前维生素D₃峰的峰面积。

1.6 测定法

取供试品溶液进行测定，按下列公式计算维生素D₃及前维生素D₃折算成维生素D₃的总量(c_i)：

$ {c_i} = {f_1}{A_{i1}} + {f_2}{A_{i2}} $

式中:A_i1为维生素D₃的峰面积；A_i2为前维生素D₃的峰面积。

2 结果与讨论 2.1 方法专属性

按照1.2项所述方法制备系统溶液，按照1.3项所述方法制备样品溶液，测定结果分别如图 1、图 2所示。

由图 1、图 2可知：空白溶剂及空白辅料对维生素D₃的检测没有干扰，前维生素D₃峰与反式维生素D₃峰以及维生素D₃峰与速甾醇峰的分离度分别为1.3、2.5，满足中国药典关于系统分离度的要求^[10]。

2.2 测量线性与范围

在进样溶液浓度0.9896~1.4844 μg/mL范围内取5个点。以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归。结果如图 3所示。

由图 3可知：在0.9896~1.4844 μg/mL范围内，线性相关系数r=0.9998，线性关系良好。

2.3 精密度试验

1) 重复性试验：取碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)，按照1.3项下方法制备6份供试品，含量测定结果的RSD为1.4%，表明维生素D3含量测定方法重复性良好。

2) 中间精密度试验：由两名实验人员分别制备6份供试品溶液，并分别在两台液相色谱仪上测定，含量测定结果的RSD为1.0%，表明该方法具有良好的中间精密度。

2.4 供试品溶液稳定性

取供试品溶液，于室温下分别放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，分别测定维生素D₃的峰面积，以6次测得峰面积的RSD评价样品溶液稳定性。结果如表 1所示：维生素D₃峰面积的RSD为1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 方法准确度

向空白辅料中加入适量维生素D3粉，按1.3项方法制备样品溶液，测定回收率，评价测定方法的准确度。具体操作方法为：称取空白辅料30 g共9份，分别置于250 mL碘量瓶中，再分别加入维生素D₃粉9.6 mg、12 mg、14.4 mg，依1.3项下方法分别制得80%、100%、120%浓度的样品溶液，每个浓度分别制备3份样品。回收率结果如表 2所示。

由表 2可知：在80%~120%样品浓度范围内，平均回收率为100.17%，RSD为1.6%，表明该测定方法具有较好的准确度。

2.6 耐用性试验

变更流速±0.2 mL/min、柱温±5 ℃、流动相比例0.2‰和色谱柱等条件，分别测定同一批碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)样品。测定结果的RSD为1.3%，表明该方法耐用性良好。

3 结论

碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)中维生素D₃含量很低且为明胶包裹物，一直以来其分析过程操作繁琐，样品回收重现性差。碳酸钙D₃咀嚼片(Ⅱ)是临床大量使用的一种钙补充剂，对其准确定量意义显著。本文采用二甲亚砜、水及甲醇等极性溶剂在50 ℃条件下使维生素D₃粉的明胶层溶胀，释放其中的维生素D₃，再在室温条件下使用非极性溶剂正己烷振摇提取一次，提取液离心后直接进样。经验证，该方法可以较好地解决维生素D3难以从凝胶包裹层中完全提取的问题，且整个分析过程操作简便快捷，易于掌握。该方法具有良好的实用性，适合推广使用。