肽是蛋白质降解后产生的一类分子量介于氨基酸与蛋白质之间的化合物, 通常由几个至几十个氨基酸组成。生物活性肽是指具有特定生物学功能的多肽, 相对分子质量小于6 000 Da。生物活性肽能直接被机体快速吸收, 吸收率超过蛋白质和氨基酸。生物活性肽具有多种生理功能特性^[1]。根据生理学功能可分为抗菌肽、神经活性肽、免疫活性肽和抗氧化肽等。如从亚麻籽蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中分离的二肽IR、KF和EF在体外显示肾素抑制作用^[2]；从紫贻贝蛋白水解物中分离的多肽EVMAGNLYPG具有降血压功能^[3]；从明胶中分离的肽HGPLGPL具有抑制脂质过氧化功能^[4]。

利用肽独特的功能来生产功能性食品、保健品、医用食品等, 应用前景广阔。生物活性肽的研发、应用离不开其高效的制备和鉴定技术。综述了国内外生物活性肽的制备和鉴定技术的研究进展, 为生物活性肽的研发提供参考。

1 生物活性肽的制备技术

生物活性肽的制备方法主要有化学水解法、酶解法、微生物发酵法三种。不同的制备方法得到的肽的纯度、理化性质和功能活性不同。其中酶解法最常用, 制备的多肽安全性高, 易被人体消化吸收, 且生产条件温和、易控制。

1.1 酶解法

酶解法是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和碱性蛋白酶等蛋白水解酶制备活性肽。不同蛋白酶的酶切位点不同, 制备的多肽的种类、大小、生物活性存在差异^[5]。Himani^[6]分别用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解小米蛋白, 胰蛋白酶水解液中肽的含量(2.14%)显著高于胃蛋白酶水解液(1.53%)。对胰蛋白酶水解物进行纯化, 发现水解后小米蛋白的抗氧化活性显著提高。这是因为水解过程增强了肽清除自由基的能力。

酶法制备多肽时, 需要研究酶的种类、用量、底物浓度、温度、pH、时间等参数对制备多肽的影响。不同条件制备的多肽的质量和纯度不同。杨雪^[7]用酶解法制备菜籽多肽, 通过单因素逐级优化实验最终采用碱性蛋白酶酶解, 最佳条件为底物浓度4%、加酶量7%(E/S)、温度50 ℃、pH 8.5、酶解时间120 min、多肽含量为35.4 mg/mL。张周莉^[8]采用响应面法优化酶解法制备猪肩胛骨抗氧化肽, 筛选出风味蛋白酶为最优酶, 在最优酶解工艺参数下获得的肽的得率为62.80%。Bah^[9]用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和真菌FP400和FPII的蛋白酶水解动物血液制备多肽, 选用木瓜蛋白酶水解生成的红细胞水解产物表现出更高的三价铁还原抗氧化剂能力(FRAP)和氧自由基吸收能力(ORAC)。

采用复合酶水解法能够克服酶作用的单一性及水解效率较低的弊端, 能提高酶解效率。刘静^[10]用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶协同水解大豆蛋白制备小分子大豆肽, 3种酶协同水解明显优于单酶, 制得的大豆肽相对分子质量集中在6 000 Da以下。多酶复合水解也能降低多肽的苦味值, 林洋^[11]筛选出碱性、中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解豆粕制备大豆肽, 通过对比单酶、双酶及3种酶酶解豆粕的水解度和苦味值两项, 发现3种酶组合使用制备大豆肽水解度更高、苦味更低。

1.2 微生物发酵法

微生物发酵生产生物活性肽, 是利用微生物发酵过程产生的蛋白酶将蛋白质分子分解成多肽或游离氨基酸的工艺, 发酵的同时还会产生蛋白酶以外的酶来降解复杂的碳水化合物和脂质^[12]。常用的微生物有枯草芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母等。

吕靖^[13]采用米曲霉和枯草芽孢杆菌共生发酵魔芋粉制备魔芋多肽。刘晓艳^[14]用枯草芽孢杆菌、米曲霉和酿酒酵母固态发酵法生产大豆多肽, 最终发酵物中多肽得率达54.89%, 发酵产物中多肽含量为21.47%, 枯草芽孢杆菌和米曲霉分泌蛋白酶可以降解基料中的蛋白质, 使其分解成小肽, 米曲霉可以将淀粉和纤维素降解为简单糖类物质, 酿酒酵母分解糖类, 产生醇香味, 增加多肽饲料的适口性。王勇^[15]采用复合菌共生发酵法制备甘薯蛋白肽, 枯草芽孢杆菌与黑曲霉按1.5:1.0比例混合, 用混合菌种发酵甘薯蛋白粉, 产生的内肽酶和端肽酶可将甘薯蛋白水解为具有一定DPPH自由基清除能力以及还原能力的小分子肽类物质。

微生物代谢活动产生的混合酶可以将生物活性肽水解释放, 同时微生物可借助多肽水解液提高生长及产酶能力, 循环协作, 效率更高。虽然微生物发酵法具有成本低、蛋白酶产量高等优点, 但是微生物发酵及代谢过程复杂, 产物难以控制, 会产生很多杂质, 对于后期的分离纯化有一定的难度。

1.3 化学水解法

化学水解法是指在一定温度下, 通过化学试剂将蛋白质分子的肽链断裂, 使之形成小分子多肽物质的方法^[16], 包括酸水解法和碱水解法。酸水解法的成本低, 但导致色氨酸完全破坏, 蛋氨酸部分丢失, 谷氨酰胺转化为谷氨酸, 天冬酰胺转化为天冬氨酸。碱水解法也具有成本低的优点, 并且可以获得100%的色氨酸回收率。然而, 导致大多数原子吸收光谱完全破坏。赵林^[17]以蚕丝为原材料, 用高温高压碱法进行水解, 得到丝胶多肽水解液, 最佳水解条件为:温度120 ℃, pH11, 时间4 h。

酸碱水解法相对简单, 生产成本低, 但水解条件难以控制, 氨基酸易破坏, 产品质量不稳定, 所以此法多用于实验室研究, 不适合工厂生产。

2 生物活性肽的分离纯化技术

多肽的种类繁多, 根据多肽与蛋白质、氨基酸的分子量不同、电荷性质和多少、疏水性等理化性质选择适宜的分离纯化方法。常用的分离纯化方法包括化学浸提法、盐析法、超滤法、色谱法等。每种方法分离程度不同, 需要将几种方法组合在一起进行生物活性肽的分离纯化。初步选用超滤、凝胶过滤层析进行分离纯化后再通过高效液相色谱分离出最后的目标组分。

2.1 化学浸提法

化学浸提法是指使用化学试剂直接提取生物活性肽的方法。该法操作简便, 成本较低。但耗费能源较多, 挥发出的有机溶剂对周围环境污染较大。常用的提取方法是溶剂萃取法, 目前常用的提取溶剂有水、乙酸、乙酸铵、高氯酸等^[18]。忽晓平^[19]采用酸溶醇沉法从金华火腿提取多肽, 研究了盐酸、磷酸盐缓冲溶液两种浸提液和乙醇的体积分数对金华火腿粗多肽提取效果的影响, 结果表明乙醇沉淀大蛋白除杂, 多肽提取率达4.64%。孟春英^[20]根据抗菌肽的阳离子特性, 用5%乙酸浸提法以仿刺参体壁为原料进行粗提, 以抑菌活性为指标分离抗菌肽, 效果显著。

2.2 盐析法

盐析法是在溶液中加入硫酸铵、硫化钠或氯化钠等中性盐使其达到饱和度而析出蛋白质或多肽。张虹^[21]对大豆蛋白酶粗提液经硫酸铵分级沉淀可以得到不同饱和度的九个盐析组分。吴疆^[22]对提取的抗菌肽溶液进行两次硫酸铵盐析, 得到的抗菌肽样品可以达到直接电泳纯化的纯度, 说明通过两次硫酸铵盐析方法可以很大程度提高乳源抗菌肽的纯度。

盐析法析出的蛋白质或多肽为可逆性变性, 一定条件下可恢复活性, 操作简便, 多次盐析可提高产物纯度。

2.3 超滤

超滤是以压力差为推动力的一种膜分离过程。一般使用1~10 kDa的膜分离生物活性肽, 滤膜孔径在0.001~0.005 μm之间, 在田少军^[23]采用不同截留分子量的超滤膜进行超滤分离大豆分离蛋白酶解液, 通过研究超滤过程中操作压力、料液质量浓度、超滤时间对超滤膜通量的影响, 并测定各超滤成分清除·OH与DPPH·的能力, 操作压力0.2 MPa、料液质量浓度50 g/L、通过相对分子质量为10 kDa、3 kDa、1 kDa超滤膜, 操作时间80 min的超滤条件下分离大豆肽, 超滤效果较好。

超滤操作简便, 设备简单, 成本低, 更适合工厂生产, 但是超滤膜容易堵塞, 需要及时清理更换, 且分离的多肽分子量相差不能太小。

2.4 色谱法

色谱法又称层析法, 是常用的肽分离纯化方法, 具有很好的分离能力。根据分离原理的不同, 分为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。高效液相色谱法(HPLC)常用于混合物中复杂组分的分离以及与其他技术联用进而对分离的物质进行定性和定量分析。多肽主要是根据极性(疏水性)的差异而进行分离, 根据流动相和固定性的极性不同分为正相色谱和反相色谱, 在多肽的分离纯化中应用最多的是反相色谱(RP-HPLC), 约95%使用C18反向硅胶层析介质。徐坤^[24]基于高效液相色谱的分离性能和多级质谱的结构鉴定能力, 建立了多肽的超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS)分析法。在工业规模上, 与提纯生物活性肽相关的加工成本必须根据提纯或半提纯产品的价值进行评估。当活性肽的高纯度对于商业化至关重要时, 也可以使用半制备型色谱。

该法具有分离能力强、柱效高、操作简单、分辨率和灵敏度高和良好的可重复性等优点。

3 生物活性肽定性定量鉴定技术

多肽的定性检测技术主要包括多肽的结构测定和序列测定；多肽的定量检测技术包括多肽含量检测、分子量大小及分布检测和纯度鉴定等。检测方法最早是N末端序列测定法、核磁共振技术, 后来质谱技术被广泛应用于多肽的分析鉴定。

3.1 末端序列测定法

最早的蛋白质多肽测序方法主要是末端序列测定法, 分为C端测序和N端测序, 经典方法是Edman化学降解法^[25]。该法在降解多肽过程中操作简单, 效率很高, 但是不适于N-端封闭的环形多肽, 常与其他方法联用, 这种传统的多肽测定方法已经被慢慢取代。孙敬敬等^[26]先采用多次反相高效液相色谱分离出具有抗菌活性的多肽, 然后经多肽N端测序, 分析出该抗菌肽由55个氨基酸残基构成, 含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。

3.2 核磁共振技术

二维三维以及四维核磁共振(NMR)结合计算机技术被广泛应用于多肽的定性定量研究。NMR多适用于小于30个氨基酸残基的小分子多肽的分析。Xie^[27]采用2D NMR光谱检测出由16~21种氨基酸组成的套索肽的序列结构, 由此把NMR作为套索肽结构测定的主要工具。但是用此法分析多肽的研究较少。

3.3 质谱法(MS)

质谱法主要通过对多肽离子质荷比的分析, 测定其分子量、分子结构来对多肽进行定性分析的一种方法。质谱分析具有高灵敏度、高准确度等优点, 为多肽的结构测定提供了新途径。

鉴定时经常将各种分离型仪器与质谱结合应用, 将具有高效、快速分离的液相色谱或毛细管的高分离能力与灵敏准确的质谱的结构鉴定功能相结合^[28], 并研发出一系列联用设备。如毛细管电泳-电喷雾电离质谱(CE-ESI-MS), 到目前为止, 在单次CE分析(单次激发分析)中鉴定的最大数量大约是50个肽。Fernando等^[29]采用CE-MS分离鉴定从牛奶蛋白水解物中提取的营养品中的降压肽, 采用具有C18吸附剂的固相萃取(SPE)进行样品处理, 最后分离鉴定了17种降血压肽。Sergio等^[30]使用CE-TOP-MS分离鉴定三种低过敏性婴儿配方奶粉中的生物活性肽, 最后鉴定了92种生物活性肽, 其中还有一些是血管紧张素转化酶的抑制剂。Anisa Elham等^[31]将N-甲基聚乙烯醇吡啶聚合物与ESI-MS(CE-ESI-MS)联用作为CE的二氧化硅表面改性剂, 通过对多肽和蛋白质消化液的分析, 证明了其与ESI-MS的相容性。表面涂层与ESI高度相容, 有利于复杂肽混合物的分离和分析。

1988年出现电喷雾技术(ESI-MS)和基质辅助激光解吸技术(MALDI-TOF-MS), 软离子技术与质谱技术联用使多肽的分析鉴定获得了迅速的发展, 分子量分析范围达到几千。Guijie Zhu^[32]优化了毛细管区带电泳(CZE)电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS), 采用电动泵浦的纳米喷雾界面, 涂层毛细管和用于样品进样的堆叠条件, 通过优化的单次CZE-ESI-MS/MS鉴定出了1 250种肽。优化后的CZE-ESI-MS/MS可用于大规模、全面和可靠的蛋白质组学分析。

近几年电喷雾技术(ESI-MS)和基质辅助激光解吸技术(MALDI-TOF-MS)应用较多。MALDI-TOF-MS是目前多肽分析鉴定的必备工具, 具有操作简单、快速、谱图直观、高灵敏度高高分辨率高采集速度所需样品量非常少等特点, 特别适合于多肽、大分子蛋白等序列结构测定。ESI-MS不但具有普遍的适用性, 同时还具有测量速度快、适合大批量样品分析等诸多特点并且具有灵敏度和高效等优势。现在多把液相和质谱技术串联, MALDI、ESI和TOF飞行时间联用, 适合于具有高相对分子质量的化合物及混合物分析。

4 结语

生物活性肽可用于食品、医药、保健等领域, 具有极大的开发潜力, 然而因其制备的产物成分复杂且含量较低, 制约了其开发利用。当前的生物活性肽的制备分离技术还存在不足之处, 虽然现在研究者们多使用多种方法联合制备实现方法互补, 多级分离, 获得高纯度的目的肽, 但是还存在成本高、操作繁琐、回收率底等问题, 不适合工厂规模化生产。

生物活性肽的鉴定, 随着蛋白质组学发展、质谱和软离子技术结合, 基于质谱定性定量分析成为多肽鉴定的主要方向, 质谱图的精准度是多肽分析的关键, ESI-MS高电荷离子实现分子量的精确定量, 精确分子结构信息, 因此, ESI-MS与其他技术串联分析具有特定功能的生物活性肽, 具有良好的发展前景。现在我国生物活性肽的研究发展迅速, 开发出高效精准肽分离鉴定技术, 为多肽类食品的研发和质量控制提供技术支撑, 推动生物活性肽的健康规范发展。