1 前 言

聚合物胶束是由两亲性嵌段共聚物自组装形成的以疏水基团为内核、亲水基团为外壳的分子有序聚集体^[1]。胶束独特的化学结构^[2]，可以将药物增溶在内部，降低药物的毒副作用，提高药物的稳定性，达到缓控释目的。同时胶束具有纳米尺寸，分子分布较窄，可以通过增强的渗透滞留效应实现在靶点的积累^[3]。

盐酸乌拉地尔能有效地降低心肌耗氧量且不损害肾功能。但因其吸收快，血压迅速降低，致使患者出现头痛、呕吐等不适症状^[4,5]。为了维持平稳持久的血药浓度，减少不良反应，提高药物利用率，可以将其制成载药胶束。有文献报道采用透析法制备PLLA-PEG共聚物胶束^[6]，胶束平均粒径约为250 nm，具有稳定、紧凑的结构。但因透析法的驱动力是膜内有机溶剂与膜外蒸馏水产生的渗透压，因此制备的胶束有机物残留量大，废水多。而直接溶解法和有机溶剂挥发法制备的胶束粒径较小，且直接溶解法用水量低，有机溶剂挥发法可获得较高的包封率^[7]。

本文合成了生物相容性良好、具有降解性的聚L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PLLA-PEG)，并采用直接溶解法和有机溶剂挥发法制备出一系列胶束溶液，使盐酸乌拉地尔的包封率最高可达到52.4%。载药胶束的体外释药行为表明，PLLA-PEG胶束对盐酸乌拉地尔有较好的缓释作用。

2 实验部分 2.1 试剂与仪器

丙交酯(自制)，聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)，辛酸亚锡(Sigma公司)，丙酮(天津市富宁精细化工有限公司)，盐酸乌拉地尔(西安利君制药厂)，溴百里香酚蓝(上海试剂三厂)。

微量进样器(宁波市镇海玻璃仪器厂)，透析袋(截留分子量：1000~1500，华美生物工程公司)，紫外/可见分光光度计(北京北分瑞利有限公司)，激光粒度仪(美国Malvern公司)。

2.2 PLLA-PEG嵌段共聚物的合成

将一定量丙交酯、PEG、辛酸亚锡加入100 mL的三口圆底烧瓶中，通入N₂数分钟后，用塞子密封并在105℃下熔融，磁力搅拌均匀，140℃下反应8 h，得白色固体。再将此白色固体用DMF溶解，搅拌滴入乙醚，抽滤，真空干燥，可得纯净PLLA-PEG-PLLA三嵌段共聚物。

与三嵌段共聚物合成方法相似，用mPEG代替PEG与一定量丙交酯聚合，可得PLLA-mPEG两嵌段共聚物。

2.3 PLLA-PEG/b>嵌段共聚物胶束的制备

直接溶解法：称取适量PLLA-PEG-PLLA或PLLA-mPEG倒入250 mL烧杯中，加入100 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌24 h，离心除去不溶物，得到透明胶束溶液。

有机溶剂挥发法：称取适量PLLA-PEG-PLLA或PLLA-mPEG溶于20 mL丙酮中。另取250 mL烧杯，加入100 mL蒸馏水，将上述丙酮溶液缓慢滴加到蒸馏水中，搅拌并置于通风橱中以保证丙酮完全挥发，离心除去不溶物，得到透明胶束溶液。

2.4 载药胶束的制备

直接溶解法：称取适量共聚物和盐酸乌拉地尔，置于250 mL烧杯中，加入100 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌24 h，离心除去不溶物，得到载药胶束溶液。

有机溶剂挥发法：称取适量共聚物和盐酸乌拉地尔，溶于20 mL丙酮中，磁力搅拌至完全溶解。缓慢滴加到100 mL蒸馏水中，搅拌过夜至丙酮完全挥发，离心除去不溶物，得到载药胶束溶液。

2.5 PLLA-PEG嵌段共聚物的¹H-NMR及分子量测定

采用INOVA-400MHz 核磁共振仪，以CDCl₃为溶剂、四甲基硅烷(TMS)为内标，测定样品的结构。

根据¹H-NMR谱图中PLLA的甲基吸收峰面积S_甲基与PEG亚甲基质子吸收峰面积S_亚甲基的比例关系得出共聚物分子量，公式如式(1)。

$M(实际) = \frac{{4 \times S甲基}}{{3 \times S亚甲基}} \times m \times 72 + MPEG$

(1)

其中，m—乙二醇单分子的个数，当所选PEG分子量为1000、2000时，m分别为23、45；M_(实际)—共聚物分子量；M_PEG—PEG的分子量。

2.6 临界胶束浓度(CMC)测定

用溴百里香酚蓝(BTB)作探针，通过紫外/可见分光光度计测试胶束溶液的临界胶束浓度(CMC)。具体为：配制共聚物水溶液(0.01%~0.1%)(wt)和浓度为1%(wt)的溴百里香酚蓝-甲醇溶液，在不同浓度的共聚物水溶液中分别加入20 μL的溴百里香酚蓝-甲醇溶液，室温静置24 h。在591 nm处测量吸光度，以溶液浓度的log值为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得到CMC值。

2.7 胶束的粒径测试

用英国Malvern公司生产的ZEN3690型激光粒度仪进行测量。测定温度25℃，测量时间3 min。

2.8 胶束的形貌测定

取20 μL胶束溶液，用1%磷钨酸染色并滴加于铜丝网上。待胶束固定在网格后，用Hitachi公司HT-7700透射电子显微镜观测其形貌。

2.9 胶束的载药量和包封率

准确称量载药胶束适量，加入其三倍体积的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)，破坏胶束结构，紫外测定吸光度。根据盐酸乌拉地尔的标准曲线，依公式计算出包载药物的含量。

$包封率 = \frac{胶束中药物的质量}{投入药物的质量} \times {\rm{100}}\% $

(2)

$载药量 = \frac{包埋的盐酸乌拉地尔的质量}{共聚物和包埋的盐酸乌拉地尔的总质量} \times {\rm{100}}\% $

(3)

2.10 载药胶束的体外释药性能测定

准确配制盐酸乌拉地尔的标准溶液，浓度为 6.0 μg⋅mL^-1。放入紫外分光光度计，盐酸乌拉地尔在269 nm 处有最大吸收，辅料在此波长处基本无干扰。首先，绘制盐酸乌拉地尔的标准曲线：准确配置浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg⋅mL^-1的盐酸乌拉地尔 PBS 溶液。在 268 nm 处测定吸光度 A，以A 对浓度C 线性回归，得标准曲线方程 C=12.622A-0.217 (R=0.9993)。此结果表明盐酸乌拉地尔在2.0~10.0 μg⋅mL^-1浓度范围内与吸光度 A 呈良好的线性关系。

再测定载药胶束的体外释药性能：取配置好的载药胶束溶液20 mL加入截留分子量为1500的透析袋中，并置于100 mL的PBS溶液中，37℃下恒速震荡进行释药测试。分别于0.5、1、2、4、6、12 h时取样，之后每隔12 h取样，每次取样10 mL，同时补充PBS溶液10mL。准确测定样品溶液在最大吸收波长处的吸光度，计算累积释放率，并绘制药物释放曲线^[8]。

$Q = \frac{{V{C_t} + \sum\limits_{i = 1}^{t - 1} {{V_s}{C_i}} }}{m}$

(4)

其中C_t－t时刻释放液的药物浓度(mg⋅mL^-1)；C_i－i时刻释放液的药物浓度(mg⋅mL^-1)；V－释放介质体积(mL)；V_s－检测时的取样体积(mL)；m－总投药质量(mg)。

3 结果与讨论 3.1 PLLA-PEG共聚物¹H-NMR分析

图 1、2中，1.52 ppm处是PLLA中(-OCH(CH₃)CO-)重复单元-CH₃的质子峰；5.23 ppm附近是PLLA中(-OCH(CH₃)CO-)重复单元-CH-的质子峰；在δ= 3.70处是PEG中(-OCH₂CH₂-)重复单元-CH₂-的特征峰，这与文献^[9~11]一致，说明已成功将PEG接枝到PLLA上。

3.2 共聚物在水中的胶束行为

用溴百里香酚蓝测定共聚物水溶液CMC，结果如表 1所示。具有相同亲水嵌段PEG的共聚物胶束，随着疏水段PLLA链长度增加，CMC逐渐降低。因为疏水PLLA链段越长,形成的胶束具有更加稳定的结构，CMC就越小。相反，对于具有相同疏水嵌段PLLA的胶束，随着PEG分子量的增大，CMC随之增大。此外，对于具有相同嵌段比的共聚物，PLLA-mPEG胶束的CMC高于PLLA-PEG-PLLA胶束，说明三嵌段共聚物更易形成胶束。因为相比PLLA-PEG-PLLA，PLLA-mPEG分子链的活动性更大。

由表 1看出，37℃制备的胶束CMC值比20℃下的低。随着温度升高，PLLA链段疏水性增强，故具有更低的临界胶束浓度。同时，由于聚合物胶束是一个动力学上的稳定平衡体系，温度升高，分子链的灵活性增强，也增大了PLLA链段形成胶束内核的机率。

3.3 胶束粒径及粒径分布

表 2是共聚物亲疏水链及制备方法对胶束粒径的影响。不同的共聚物组成，粒径也不同，PLLA-PEG-PLLA中PEG链长度增加，胶束粒径随之增大。此外，具有同样嵌段比的共聚物，PLLA-PEG-PLLA三嵌段共聚物胶束的粒径略小于PLLA-mPEG两嵌段的。因为PLLA-PEG-PLLA的分子链折叠性更高，中间PEG亲水链向外，而两端PLLA疏水链段形成内核，形成的胶束结构更加紧密，粒径也较小。

对于组成相同的共聚物，有机溶剂挥发法制备的胶束粒径略小于直接溶解法制备的胶束粒径。

图 3是直接溶解法制备的不同共聚物的粒径分布图，从图看出胶束粒径分布集中，体系中只存在胶束这一种聚集体。

另外，温度对胶束粒径也有影响，如表 3所示。温度从15℃增大到25℃，共聚物胶束的粒径也呈现增大的趋势。温度升高，分子链的灵活性增大，进入到胶束中的水分子也越多，胶束膨胀，因而具有大的粒径。

3.4 胶束的形貌

通过透射电镜观察有机溶剂挥发法制备的胶束，其形貌见图 4，可以看出PLLA-PEG-PLLA的粒径约在70 nm，PLLA-mPEG的粒径在100 nm左右。

3.5 胶束的载药量和包封率

实验发现，制备方法会对药物的包载产生影响。由表 4看出，相同条件下，有机溶剂挥发法制备的胶束载药量和包封率都明显高于直接溶解法。因为直接溶解法首先是盐酸乌拉地尔在水中溶解，然后在亲疏水力作用下，扩散进入聚合物胶束内部。它是一个逐步包载药物的动态过程，受盐酸乌拉地尔在水中溶解速率和扩散速率的影响。

有机溶剂挥发法是将药物和共聚物一起溶解在丙酮，然后加入水中，随着溶剂的挥发，开始形成胶束。该方法是胶束一次性包裹药物的过程，制备的胶束和药物分布性较好。由于药物是一次性的溶解和包载，所以它是一个不随时间变化的静态载药过程。

另外，共聚物的组成也会对载药产生影响。两嵌段PLLA-mPEG分子链灵活性高于三嵌段PLLA-PEG-PLLA，所以形成的胶束较松散，载药量和包封率较低。

3.6 载药胶束对盐酸乌拉地尔的体外释放性能

由PLLA-PEG胶束包裹盐酸乌拉地尔的释放行为如图 5所示，各胶束体系在48 h时药物累积释放约为50%，说明胶束对盐酸乌拉地尔具有明显的控制释放能力。另外，有一部分盐酸乌拉地尔吸附在胶束界面，这些游离药物在初始释放阶段更容易扩散进入人体，导致药物在前5h有突释。

共聚物的链段结构会影响胶束对药物的释放，与PLLA-PEG-PLLA胶束相比，PLLA-mPEG胶束对药物的释放速率更快。PLLA-PEG-PLLA分子链折叠性高，形成更加紧密的结构，包载在胶束中药物的扩散比较困难。

4 结 论

(1) 采用直接溶解法和有机溶剂挥发法制备了PLLA-PEG-PLLA和PLLA-mPEG胶束，PEG分子量、嵌段比、制备方法、温度等对胶束粒径均有影响。胶束粒径分别随着PEG及PLLA链段长度的增加而增大。有机溶剂挥发法制备的胶束粒径小于直接溶解法。温度升高，胶束的粒径增大。

(2) 共聚物组成以及载药方式对胶束的载药、释药行为有一定影响，当PEG与LLA的摩尔比为1:20时，溶剂挥发法制备的PLLA-PEG1000-PLLA胶束载药量可达12.2%，包封率高达52.4%，明显高于直接溶解法；具有相同嵌段比的共聚物，三嵌段共聚物胶束的载药量和包封率高于两嵌段的，且三嵌段共聚物胶束的累积释放率低于两嵌段。与原料药的体外释药相比，胶束对药物具有明显的缓释作用，三嵌段共聚物胶束在载药体方面具有更大的潜能。