2. 北京阳光诺和药物研究有限公司，北京 100043;
3. 河南省天然药物化学院士工作站，河南 郑州 450001
2. Beijing Sun-Novo Pharmaceutical Research Co. Ltd., Beijing 100043, China;
3. Academician Workstation of Natural Medicinal Chemistry of Henan Province, Zhengzhou 450001, China
阿伐那非是一种用于治疗ED (Erectile Dysfunction)的新药，2012年4月27日由美国FDA (Food and Drug Administration)批准上市[1~3]；(S)-4-(3-氯-4-甲氧基苄氨基)-2-(2-羟甲基-1-吡咯烷基)-5-嘧啶甲酸乙酯(3)的合成是阿伐那非合成路线中的关键步骤之一[3]。合成化合物3关键的一步是将硫醚氧化为砜或亚砜(图 1)。 2012年Das等[4]以W(VI)配合物催化H2O2氧化硫醚和二苯并噻吩，在室温下将其选择性氧化为亚砜；2015年，Doherty等 [5]通过金属过氧化物与吡咯烷鎓盐衍生物的阴离子交换作用，将离子液体固载到金属过氧化物的骨架上，得到[PO4{WO(O2)2}4]@PIILP，可催化H2O2将硫醚选择性氧化为砜与亚砜；Shi[6]，Afrasiabi[7]，Fazaeli[8]，Karimi等[9]分别通过不同的方法，合成了W催化剂，在温和条件下用H2O2将硫醚选择性氧化为砜或亚砜。在上述报道的参考文献中，大部分都需要制备较为复杂的催化剂，且反应底物多为芳基与烃基组成的结构较为简单硫醚，很少含有嘧啶环或较多杂原子的复杂结构，而此类化合物在医药合成中具有重要的作用；2004年Yamada等[10]用间氯过氧苯甲酸将此类硫醚氧化为砜，产率60%~70%，但其氧化剂非绿色氧化剂。本实验用含有嘧啶环的硫醚为反应底物，H2O2为氧化剂，将其氧化为砜或亚砜。
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图 1 化合物3的合成路线 Fig.1 Synthesis route of compound 3 |
Bruker Avance 400型超导核磁共振仪(瑞士Bruker公司)，ICPMS7700型电感耦合等离子体质谱仪(深圳华普通用科技有限公司)，X-4型数字显微熔点测定仪(北京福凯科仪科技有限公司)；实验试剂均为市售分析纯，购于百灵威科技有限公司。
2.2 化合物的合成 2.2.1 4-(3-氯-4-甲氧基苄氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯(1)的合成往100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL DMF，10 mL TEA，25 mmol 3-氯-4-甲氧基苄胺盐酸盐；称取20 mmol 4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯，量取20 mL DMF将其溶解，0℃下将其滴加到圆底烧瓶中，室温下反应2 h；将反应液倒入20 mL 冰水中，得乳状液，用乙酸乙酯萃取；有机层依次用10%(wt)柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，将残余物柱层析提纯（硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚淋洗），得化合物1。白色固体，mp: 82~83℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6 ): δ = 8.78 (t,J = 5.96 Hz,1H),8.55 (s,1H),7.43 (d,J = 2.0 Hz,1H),7.29 (dd,J = 2.0 Hz,J = 8.5 Hz,1H),7.09 (d,J = 8.5 Hz,1H),4.62 (d,J = 6.0 Hz,2H),4.28 (q,J = 7.1 Hz,2H),3.82 (s,3H),2.43 (s,1H),1.30 (t,J = 7.1 Hz,3H) ppm; 13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6 ): δ = 175.4,166.2,159.6,158.4,153.9,132.7,129.5,127.9,121.1,113.1,101.2,61.4,56.5,43.0,14.5,14.1 ppm。FT-IR (KBr),v(cm-1): 3346,3058,2925,1685,1574,1377,1265,1182,928,802。
2.2.2 (S)-4-(3-氯-4-甲氧基苄氨基)-2-(2-羟甲基-1-吡咯烷基)-5-嘧啶甲酸乙酯(3)的合成称取2 mmol 4-(3-氯-4-甲氧基苄氨基)-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯(1)，量取10 mL丙酮，加入50 mL圆底烧瓶中，升温至45℃溶解；称取0.1 mmol Na2WO4·2H2O、8 mmol H2O2和2 mmol乙酸，将其混合均匀后，滴加入圆底烧瓶中；TLC点板监测反应，原料消耗完全后，加入亚硫酸钠(5%(wt))溶液消耗过量的过氧化氢，再加入饱和的碳酸氢钠溶液中和乙酸，然后用二氯甲烷萃 取，有机层经无水硫酸钠干燥后，浓缩得2a,2b混合物，用于下一步反应。
往化合物2a,2b混合物中，加入5 mL THF和2 mmol L-脯氨醇，室温搅拌反应1 h后，浓缩，将残余物柱层析提纯（硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚淋洗），得化合物3。白色固体，mp: 88-90 ℃。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6 ): δ = 8.48-8.42 (m,2H),7.35 (t,J = 3.0 Hz,1H),7.24 (d,J = 8.4 Hz,1H),7.0 (dd,J = 2.5 Hz,J = 8.4 Hz,1H),4.51 (d,J = 6.5 Hz,2H),4.16 (q,J = 7.1 Hz,2H),3.82 (s,1H),3.77 (d,J = 1.1 Hz,3H),3.59-3.52 (m,1H),3.48-3.39 (m,2H),3.30 (dd,J = 7.4 Hz,J = 10.3 Hz,1H),1.95-1.81 (m,4H),1.22 (t,J = 7.1 Hz,3H) ppm; 13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6 ): δ = 166.7,160.9,160.3,160.0,153.7,133.2,129.3,128.0,121.0,112.8,95.4,62.0,60.2,59.1,56.3,47.5,42.5,27.9,22.8,14.4 ppm。FT-IR (KBr),v (cm-1): 3329,2937,2876,1678,1601,1531,1487,1257,1122,1069,802。
3 结果与讨论 3.1 单因素实验首先硫醚1被过氧化氢选择性氧化为亚砜和砜的混合物(2a,2b)，然后与L-脯氨醇反应生成化合物3；由于第二步反应较容易发生，因此在工艺优化时只改变第一步氧化的反应条件，第二步的反应条件不变。以化合物3的产率为考察的目标函数，进行条件优化：考察了催化剂、溶剂、反应温度等条件对反应的影响，结果见表 1。
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表 1 单因素实验 Table 1 Design of the single factor experiment |
由表 1中Entries 1~4可知钨酸钠作催化剂时产率最高，接下来另外分别选用四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸、乙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇为溶剂进行实验，结果显示用丙酮作溶剂的反应结果最好。
如图 2所示，在30~40℃，随着反应温度的升高，产率升高，在40℃时达到最大值67%；继续升高温度至40~55℃，产率急剧下降；低于40℃时，升高反应温度，反应速率加快，产率升高；当温度过高时，随着反应温度升高，可能导致过氧化氢的分解加快，加入的过氧化氢还未进行反应就已经分解，产率开始下降。
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图 2 反应温度对产率的影响 Fig.2 Effects of reaction temperature on reaction yields |
如图 3所示，随着过氧化氢用量增加产率升高，过氧化氢:硫醚=4.5:1(摩尔比)时达到最大；当摩尔比为4.5~5.5时，随着过氧化氢用量的增加，产率下降。当摩尔比在3~4.5时随着过氧化氢用量的增加，硫醚被氧化得更充分，产率提高；摩尔比超过4.5以后可能会过度氧化，嘧啶环上的氮被氧化，导致产率下降。
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图 3 过氧化氢用量对反应产率的影响 Fig.3 Effects of hydrogen peroxide amount on reaction yields |
如图 4所示，反应3~4 h，产率随反应时间的延长显著增加；反应4~6 h，产率随反应时间的延长缓慢增加；6 h以后，再延长反应时间，产率基本不变。
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图 4 反应时间对反应产率的影响 Fig.4 Effects of reaction time on reaction yields |
在单因素实验分析的基础上，选取反应时间(X1/ h)、反应温度(X2/℃)、过氧化氢用量(X3/ molar ratio)为响应面设计的考察因素。每个因素取+1、0、-1三个水平，以化合物(3)的产率(Yield/%)为目标函数，设计三因素三水平17个实验点的响应面设计实验，其中12个析因点，5个中心点。根据实验方案安排实验，分析实验数据进行二次回归拟合，得到含有交互作用项和平方项二次回归方程，在实验水平的范围内求出最优解。本实验设计及数据处理是在软件Design-Expert 8 .0.5中的Box-Behnken Design(BBD)选项的辅助下完成的[11]。各实验因素的水平及编码见表 2，实验方案设计及结果见表 3。
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表 2 响应面实验因素和水平编码表 Table 2 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design |
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表 3 响应面实验设计及结果 Table 3 Response surface design and experimental results |
利用Design-Expert 软件处理实验结果，得到二次拟合方程Y = + 73.50 + 2.24X1 + 0.89 X2 + 2.28 X3+ 0.85 X1 X2- 0.075 X1 X3+ 0.025 X2 X3 + 1.07 X12- 9.03 X22 - 15.8 X32(编码值)，方程中系数为正数的项，说明该项与目标函数为正相关，方程中系数为负数的项，说明该项与目标函数负相关，其绝对值越大，说明对目标函数的影响越大。对回归方程系数显著性分析见表 4，结果表明：各响应因子反应时间(X1)、反应温度(X2)、氧化剂过氧化氢的用量(X3)的 Prob＞F项均小于0.01，说明X1、X2、X3为高度显著模型项；交互作用项X22、X32的Prob＞F项小于0.01，X22、X32为高度显著模型项，X1X2、X12的Prob＞F项小于0.05，X1X2、X12为显著模型项，而X1 X3、X2 X3项的Prob＞F项大于0.05，X1 X3、X2 X3为不显著模型项。
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表 4 回归方程系数显著性分析 Table 4 Significance tests for each regression coefficient of developed regression equation |
实验结果进行方差分析见表 5，结果表明：模型F值364.4997，说明该模型高度显著，Prob＞F项小于 0.0001，说明只有0.01%的可能性不适合该模型，而这种可能性很可能是由于误差产生的；失拟项F值为6.281609，Prob＞F项为0.0540大于0.05，失拟项不显著，说明该方程对实验拟合较好；该回归方程的预测决定系数R2 Pred=0.9713满足调整决定RAdj2= 0.9951的要求；决定系数R2=0.9979(＞90%)且大于调整决定系数RAdj2= 0.9951，说明只有0.21%的变异不能用此模型进行描述，该模型可以较好地描述实验结果；离散系数(C.V.)，用来衡量模型的精确度，其值越大表明精确度越低，即可靠性愈低，该实验C.V. %= 1.10，符合要求，说明该模型的可信度较高；信噪比大于4即符合要求，本模型的信噪比为Adeq Precision = 52.999，说明该模型信噪比很好，可以用于设计实验方案。
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表 5 响应面实验结果方差分析 Table 5 ANOVA of the constructed regression model |
利用Design-Expert软件处理实验结果，得到三维的响应曲面图，如图 5所示：过氧化氢对化合物3产率的影响变化趋势呈抛物线形，即随着反应温度的升高，化合物3产率先增加后减小，过氧化氢用量为硫醚的4.1倍时，反应温度为41℃时，产率最大。
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图 5 反应温度和过氧化氢用量对化合物3产率的曲面响应图 Fig.5 Effects of reaction temperature and hydrogen peroxide amount on compound 3 yield |
根据响应面分析，由二次拟合回归方程：
Y= + 73.50 + 2.24 X1 + 0.89 X2 + 2.28 X3
+ 0.85 X1 X2 + 1.07 X12-9.03 X22-15.8 X32
求得最优解为反应时间7 h，反应温度40.72℃，过氧化氢用量为4.07(molar ratio)，化合物3的产率为76.8%；考虑实验的可操作性，取反应时间7 h，反应温度41℃，过氧化氢用量为4.1(molar ratio)，在此条件下做3组验证性实验，实验结果见表 6，与预测结果相符。
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表 6 验证实验 Table 6 Design and results of the verification experiment |
以4-(3-氯-4-甲氧基苄氨基)-2-甲硫基嘧啶-5-嘧啶羧酸乙酯为底物，过氧化氢为氧化剂，首先通过单因素实验考察了催化剂种类、反应溶剂、反应温度、过氧化氢用量、催化剂用量、反应时间对目标产物产率的影响；在此基础上，选择反应温度、过氧化氢用量、反应时间为考察的因素，采用Design-Expert软件的BBD方法，分析响应结果，得到二次回归方程Y = + 73.50 + 2.24 X1 + 0.89 X2 + 2.28 X3 + 0.85 X1 X2+ 1.07 X12 -9.03 X22 -15.8 X32(编码值)。
根据二次回归方程求出最优反应条件：反应溶剂为丙酮，催化剂为二水合钨酸钠(5%(mol))，辅助催化剂为乙酸(1 molar ratio)，反应时间7 h，反应温度41℃，过氧化氢用量为硫醚的4.1倍时，产率可达76.4%，验证实验与优化结果相符。
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