近年来新型冠状病毒感染成为危害人类健康的重要事件，疫苗起到了至关重要作用[1]。mRNA疫苗凭借高保护率和快速研发效率，得到了广泛关注[2]。对比灭活和减毒疫苗，mRNA疫苗能精确表达抗原、可产生更为强烈的免疫反应[3]；相对DNA疫苗和病毒载体疫苗，mRNA疫苗具有蛋白表达可预测性[4]、低免疫原性[5]、避免宿主基因组整合风险等优势[6]；此外，mRNA疫苗生产平台灵活性强、流程易标准化[7]。mRNA不仅可以作为预防疫苗，还可用于很多疾病治疗，例如流感病毒[8]、HIV病毒[9]等引发的传染性疾病，以及非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤等癌症[10]。预计2035年mRNA市场将达到230亿美元[11]。
mRNA制备包括RNA聚合酶催化下的体外转录反应和下游生物分离纯化[12-13]。T7 RNA聚合酶是使用最为广泛的体外转录反应合成酶[14]，但转录后包含较多副产物和残留物，如流产性转录起始物、双链RNA(dsRNA)、酶、转录模板DNA、未反应的核苷酸等[15]。下游生物分离纯化过程通常包含捕获和精制2个阶段[16]。对于复杂的mRNA体外转录混合物体系，由于具有3’末端多聚腺嘌呤核糖核苷酸(poly(A))这一尾部特征结构，高选择性的亲和层析是最适合的捕获方法[17-18]。目前mRNA亲和层析分离采用的配基主要有2种，寡脱氧胸腺苷酸(Oligo(dT))和多尿苷酸(poly(U))。研究表明，对于配基为poly(U)的亲和层析介质，poly(U)与含poly(A)的mRNA结合能力较强，但洗脱时需升温至65 ℃以上才能达到较高的回收率[19]，且还需额外添加减少非特异性吸附的物质，如尿素、甲酰胺等[20]；对于配基为Oligo(dT)的亲和层析介质，Oligo(dT)吸附mRNA后常温下用去离子水洗脱即可达到87% 的收率[21]。因此，绝大多数商业化mRNA亲和层析介质的配基采用Oligo(dT)，表 1汇总了现有Oligo(dT)亲和层析介质的基本信息和动态结合载量情况，表中，dp为介质微球粒径，μm；dpore为介质微球平均孔径，nm；DBC为以层析柱体积为基准计的亲和层析介质动态结合载量，mg⋅mL−1。
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表 1 常见的商业化Oligo(dT)亲和层析介质 Table 1 Typical commercial Oligo(dT) affinity resins |
由表 1可见，与文献[26]中蛋白A亲和层析介质50~80 mg⋅mL−1的DBC值相比，现有的Oligo(dT)亲和层析介质的DBC值普遍较低，难以满足规模化mRNA分离的需求[7]。因此，研发高载量的Oligo(dT)亲和层析介质非常重要，但目前缺乏对Oligo(dT) 亲和层析介质载量影响机制的探究。本研究将以poly(A)为模型分子，对比不同的Oligo(dT)亲和层析介质的静态吸附平衡、吸附动力学和DBC等性质，借助激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)表征poly(A)在介质微球内的分布，结合理论计算分析介质载量的影响因素及相关机制，为高载量Oligo(dT)亲和层析介质的研发提供依据。
2 材料与方法 2.1 主要材料与仪器主要试剂：poly(A)(货号P9403，动态光散射测得的水力学直径约为6.8 nm)，Sigma-Aldrich公司；Ribogreen荧光染料，上海闪晶分子生物科技有限公司；Poros Oligo (dT)25、Praesto Jetted(dT)25、NanoGel dT20和Monomix dT20等4种Oligo(dT)亲和层析介质的相关信息见表 1。这4种介质的基质种类不同，其中前3种介质的基质材料为聚苯乙烯，第4种介质的基质材料为聚甲基丙烯酸酯。
主要仪器：ÄKTApurifier 10 plus层析系统，GE Healthcare Life Sciences公司；Unano-1000微量分光光度计，杭州优米仪器有限公司；MultiScreenHTS真空抽滤系统(MSVMHTS00)和过滤板(MmtiScreen HTS BV)，Millipore公司；恒温混匀仪，杭州奥盛仪器有限公司；Tricorn 5/50层析柱(5 mm×50 mm)，Cytiva公司；激光扫描共聚焦显微镜(OLYMPUS IX83-FV3000)，Olympus公司；纳米粒度电位分析仪(Malvern Zetasizer Nano-ZS ZEN3600)，Malvern公司；压汞仪(AutoPore IV 9510)，Micromeritics公司。
2.2 吸附条件筛选方法考察不同pH值、盐浓度对4种Oligo(dT) 亲和层析介质的吸附性能的影响：5种pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；4种氯化钠浓度分别为0、200、400、600 mmol⋅L−1。不同pH值的缓冲液分别为20 mmol⋅L−1的柠檬酸盐缓冲液(pH值为5.0)、20 mmol⋅L−1的磷酸盐缓冲液(pH值分别为6.0和7.0)和20 mmol⋅L−1三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH值分别为8.0和9.0)。不同盐浓度的缓冲液由1 mol⋅L−1的NaCl缓冲液与相应无盐缓冲液按不同比例配制而成。
采用96孔过滤板进行静态平衡吸附量Q*测定[27]，具体步骤如下：第1步，将poly(A)溶解于缓冲液中，使之质量浓度为1.5 mg⋅mL−1，260 nm波长下精确测定poly(A) 初始质量浓度ρ0(mg⋅mL−1)；第2步，用去离子水冲洗亲和层析介质，抽滤15 min，精确称重后转移至量筒内，静置过夜，加入适量的去离子水，配成介质体积比为10%的重悬浮介质匀浆液，将96孔过滤板的每孔加入100 μL (含10 μL介质)该介质匀浆液；第3步，用200 μL缓冲液平衡该介质3次，真空抽滤，去除缓冲液；第4步，将100 μL不同条件下的poly(A)溶液加入过滤板样品孔中，用封板膜密封过滤板的顶部和底部，在25 ℃、1 200 r⋅min−1转速下恒温震荡3 h；第5步，吸附平衡后，真空抽滤，收集滤液，260 nm波长下测定滤液中poly(A)平衡质量浓度ρ*(mg⋅mL−1)，根据物料平衡计算亲和层析介质的Q*，Q*为以1g介质为基准计的poly(A)静态平衡吸附量，mg⋅g−1。
2.3 静态吸附等温线测定方法测定4种亲和层析介质的吸附等温线的方法如下：将poly(A)溶解于结合缓冲液，制备出质量浓度为4.0 mg⋅mL−1的母液，结合缓冲液含10 mmol⋅L−1 Tris、0.6 mol⋅L−1 NaCl、1 mmol⋅L−1乙二胺四乙酸(EDTA)，pH=7.0。然后将母液依次稀释至质量浓度为3.2、2.4、1.6、0.8、0.4、0.2 mg⋅mL−1。用96孔过滤板的每列8个样品孔考察特定的介质，每个浓度使用3个平行孔，每孔加入100 μL重悬浮的介质匀浆液(含介质10 μL)，用缓冲液冲洗3次，真空抽滤，去除缓冲液。将100 μL不同质量浓度的poly(A)溶液添加到相应的过滤板样品孔中，密封过滤板，在25 ℃、1 200 r⋅min−1转速下恒温震荡3 h，后续操作参照2.2节进行。用Langmuir-Freundlich方程拟合吸附等温线，具体表达式如下[28]：
| $ {Q^*} = \frac{{K{\rho ^{ * b}}}}{{1 + K{\rho ^{ * b}}}} \times {Q_{\text{m}}} $ | (1) |
式中：Qm为最大静态吸附容量，mg⋅g−1；K为亲和力常数，(mL⋅mg−1)b；b为经验常数。
由于较多的亲和层析介质在poly(A) 的测试质量浓度范围内Q*无法达到吸附等温线的平台区域，因此，本研究以ρ*为1 mg⋅mL−1时对应的静态平衡吸附量QC (mg⋅g−1)为参考，比较各介质对poly(A)的吸附能力[29]。
2.4 吸附动力学研究方法4种亲和层析介质对poly(A)的吸附动力学研究方法如下：96孔过滤板的每孔加入100 μL重悬浮的介质匀浆液(含介质10 μL)，共使用6个样品孔。用结合缓冲液洗涤介质3次，将100 μL、ρ0为1.5 mg⋅mL−1的poly(A)溶液添加到1#孔内，用封板膜密封孔的上、下端，25 ℃、1 200 r⋅min−1转速下恒温振荡。以1#孔开始震荡为0时刻，分别在0、20、40、50、55、59 min将相同的poly(A)溶液添加到1~6#孔内，连续恒温振荡孵育共60 min。最后，真空抽滤，收集滤液，测定滤液中poly(A) 质量浓度ρ(mg⋅mL−1)，得到ρ/ρ0随时间变化的吸附动力学曲线。
2.5 穿透曲线和动态结合载量测定方法使用10% 穿透的DBC (DBC10%)来表征4种亲和层析介质在层析柱内的动态吸附性能。Tricorn 5/50层析柱装填约0.5 mL介质，柱高约20 mm。用结合缓冲液充分平衡床层，直至UV260nm响应接近基线，分别在50、100、150 cm⋅h−1等流速下测定poly(A)穿透曲线，poly(A)料液质量浓度为1.0 mg⋅mL−1，按特定时间段分管收集出口样品，260 nm波长下测定收集液中poly(A)质量浓度，设定达到90% 穿透比例时终止上样，绘制穿透曲线，根据DBC10%值来确定亲和层析介质的动态结合载量。
2.6 介质吸附的微观观测采用CLSM观察poly(A)在4种亲和层析介质中的吸附过程。类似2.4节实验方法，吸附时间分别为1、5、10、20、40、60 min，以未吸附poly(A)的介质微球作为对照组，完成吸附后，真空抽滤。将介质用结合缓冲液冲洗3次，真空抽滤，配制成100 μL匀浆液(含10 μL介质)。取匀浆液10 μL，与100 μL稀释了133倍的Ribogreen染液[30]在25 ℃、1 200 r⋅min−1转速下避光振荡孵育1 h。
用CLSM观察亲和层析介质内poly(A)的分布。选择处于平均粒径附近的介质微球，选取介质微球的最大截面处，采集2维共聚焦图像。镜头选择60倍油镜、激光波长为488 nm、激光强度为饱和能量的0.1%~0.3%、光电倍增管值设为800 V、共聚焦图像的尺寸为1 024像素×1 024像素，图片经ImageJ软件处理。
2.7 静态吸附容量理论计算以典型的分子大小和平均分子量的mRNA(10 nm和100 kDa，30 nm和300 kDa，40 nm和600 kDa)为模型分子，忽略mRNA分子间的相互作用力和传质阻力，只考虑mRNA水力学直径的影响，并在单分子层吸附前提下，模拟计算亲和层析介质对mRNA的静态吸附容量Qcal(mg⋅g−1)，分析dp和dpore对Qcal的影响，并比较多孔微球对mRNA的内表面静态吸附容量Qin和外表面静态吸附容量Qex。计算式如下[28]：
| $ {a_{{\text{ex}}}}{\text{ = }}\frac{{6 \times (1-\varepsilon )}}{{{d_{\text{p}}}}} $ | (2) |
| $a_{\text {in }}=\frac{4000 \times(1-\varepsilon) \times \varepsilon_{\mathrm{p}}}{d_{\text {pore }}}$ | (3) |
| $Q_{\text {cal }}=4 \times 10^{18} \times \frac{\left(a_{\mathrm{ex}}+a_{\text {in }}\right) \times M_{\mathrm{a}}}{\pi d^2 \times N_{\mathrm{A}} \times m \times \mathrm{CF}}$ | (4) |
式中：aex、ain分别为以1 mL柱体积为基准计的微球外、内比表面积，m2⋅mL−1；ε为柱空隙率；εp为微球孔隙率；Ma为mRNA的平均分子量，kDa；d为mRNA水力学直径，nm；NA为阿伏伽德罗常数，mol−1；m为1 μL介质对应的干重，mg⋅μL−1；CF为柱压缩因子。
3 结果与讨论 3.1 吸附条件筛选不同pH和NaCl浓度条件下，Poros Oligo (dT)25、Praesto Jetted(dT)25、NanoGel dT20和Monomix dT20等4种亲和层析介质对poly(A)的Q*如图 1所示。由图 1可见，4种亲和层析介质对poly(A)的Q*值均随NaCl浓度增大而增大，这主要是因为，NaCl浓度增大对静电作用产生屏蔽效应，减弱了Oligo(dT)配基与poly(A)磷酸基团之间的电荷斥力，两者之间的碱基更容易形成氢键，从而促进了与poly(A)结合。研究中还发现，NaCl浓度过高时，poly(A)易形成沉淀，因此选用0.6 mol⋅L−1作为合适的NaCl上样浓度。由图 1还可见，高NaCl浓度下、pH=6.0~7.0时，4种亲和层析介质对poly(A)均有较高的Q*值。这是因为，弱酸性条件可能降低poly(A)磷酸基团的电离度、减小核酸带电荷量，促进Oligo(dT)配基与poly(A)之间的氢键形成。由图 1还可见，低NaCl浓度下、pH=5.0或pH=9.0时，Q*值急剧下降。可能由于在较强的酸性条件下(pH=5.0)，碱基中的N原子被质子化，氢键形成更加困难；而在碱性条件下(pH=9.0)，poly(A)的磷酸基团所带的负电荷量增大，Oligo(dT)配基与poly(A)之间的电荷排斥作用增强，导致与poly(A)难以结合。
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图 1 不同pH和NaCl浓度条件下4种亲和层析介质对poly(A)的Q*比较 Fig.1 Poly(A) adsorption capacities of the four affinity resins under different pH and NaCl concentrations |
基于上述不同pH和NaCl浓度下的Q*值分析，可确定4种亲和层析介质合适的上样条件均为NaCl浓度为0.6 mol⋅L−1、pH值为6.0~7.0。
3.2 静态吸附等温线及模型拟合基于3.1节的实验结果，为了比较不同亲和层析介质的Qm，如图 2所示，测定了pH=7.0、0.6 mol⋅L−1 NaCl条件下4种亲和层析介质的吸附等温线，并采用Langmuir-Freundlich方程进行拟合，得到的拟合参数列于表 2。
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图 2 4种亲和层析介质对poly(A)的吸附等温线及Langmuir- Freundlich模型拟合曲线(pH =7.0、0.6 mol⋅L−1 NaCl) Fig.2 Poly(A) adsorption isotherms of the four affinity resins at pH=7.0 and 0.6 mol⋅L−1 NaCl and the corresponding Langmuir-Freundlich model fitting profiles |
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表 2 4种亲和层析介质的吸附等温线Langmuir- Freundlich模型拟合参数 Table 2 Fitting results of adsorption isotherms of the four affinity resins with Langmuir-Freundlich model |
由图 2可见，Q*随ρ*增大而变大，且增长幅度逐渐变小，但吸附等温线最终并没有达到平稳阶段，这可能是核酸特有的吸附现象。随着更多的poly(A)被吸附，介质微球表面所带负电荷量增加，对溶液中游离的poly(A)静电斥力增强，且在吸附接近饱和时，核酸分子之间的空间位阻对poly(A)的吸附行为影响较大。因此，吸附等温线并不符合Langmuir方程[31]，但Langmuir-Freundlich方程拟合效果较好[21]。
由表 2可见，Poros Oligo (dT)25和Praesto Jetted(dT)25这2种亲和层析介质的静态吸附容量较低(QC分别为4.9和6.1 mg⋅g−1)，这可能是由于其dpore相对较大，导致其可及吸附表面积减小。由表 2还可见，相比于其他3种亲和层析介质，Praesto Jetted(dT)25的K值(0.578) 最小，且QC/Qm值小于40%，需要更高的poly(A) 质量浓度来达到较大的Q*值，可能是介质的配基密度、间隔臂等因素导致其对poly(A)的亲和力较弱。由图 2可见，当ρ*较高时(ρ* > 2.86 mg⋅mL−1)，Poros Oligo (dT)25介质的Q*有较大幅度增大，这说明高ρ*值可能导致吸附机理发生改变[21]。
由表 2可见，Monomix dT20和NanoGel dT20这2种亲和层析介质的静态吸附容量较大(QC分别为10.2和9.0 mg⋅g−1)。经分析，主要有以下2种解释：一是poly(A)可扩散进入这2种介质微球的孔道内，而且由于其dpore较小，可及吸附表面积大，导致静态吸附容量较高；二是poly(A)难以扩散至介质微球内部孔道，主要在微球表层吸附，由于Monomix dT20的dp(30 μm)比其他3种亲和层析介质(均为50 μm)小，故拥有较大的比表面积，从而静态吸附容量最大，而NanoGel dT20可能配基密度较高，表面可及吸附位点多，导致较大的静态吸附容量。这2种亲和层析介质的K值均接近1.00、QC/Qm值接近50%，对poly(A)的亲和性较强。原因可能是，这2种亲和层析介质的配基为dT20，链长小于Poros Oligo (dT)25和Praesto Jetted(dT)25介质的dT25，所带负电荷量较小，对poly(A)的排斥力较小，故亲和力较强。此外，间隔臂分子结构及其长度等因素也可能影响亲和层析介质的亲和力[21]。
3.3 吸附动力学为了进一步探究poly(A)在4种亲和层析介质微球中吸附行为的差异，考察pH=7.0、0.6 mol⋅L−1 NaCl条件下4种亲和层析介质对poly(A)的吸附动力学，结果如图 3所示。
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图 3 4种亲和层析介质对poly(A)吸附动力学曲线比较(pH=7.0、0.6 mol⋅L−1 NaCl) Fig.3 Poly(A) adsorption kinetics of the four affinity resins at pH 7.0 and 0.6 mol⋅L−1 NaCl |
由图 3可见，Poros Oligo (dT)25、Praesto Jetted(dT)25和NanoGel dT20这3种亲和层析介质吸附poly(A)过程中，ρ/ρ0变化主要集中在前1 min。经推测，介质与poly(A)结合主要为对流传质主导的微球表层吸附，而微球内部扩散传质主导的孔内吸附较少，因而传质阻力小，达到吸附平衡所需时间短。由图 3还可见，Monomix dT20吸附poly(A)过程中，ρ/ρ0的大幅度变化持续了约20 min，40 min后趋于稳定，达到吸附平衡。这表明，在Monomix dT20介质中可能同时存在poly(A)的表层吸附和深层孔扩散吸附，而微球内部传质阻力较大，达到吸附平衡时间较长。相比于其他3种介质，dpore最小的Monomix dT20介质中存在poly(A)的深层孔扩散吸附，可能与其聚甲基丙烯酸酯的基质材料有关。由图 3还可见，在前1 min内，NanoGel dT20介质溶液的ρ/ρ0变化最大，可能是由于该介质的配基链长、间隔臂长度等因素导致介质与poly(A)的亲和性更强；此外，配基密度高也可使该介质吸附poly(A)分子多。
3.4 动态结合载量采用DBC10%表征4种亲和层析介质在层析柱内分离过程的动态吸附性能，考察流速对亲和层析介质动态吸附过程的影响，并用DBC10%/Q (Q为上样条件下的静态平衡吸附量，mg⋅mL−1)表征传质阻力。3种流速下NanoGel dT20的穿透曲线、4种亲和层析介质在pH=7.0和0.6 mol⋅L−1 NaCl条件下的DBC10%和DBC10%/Q实验结果见图 4。
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图 4 NanoGel dT20穿透曲线及4种亲和层析介质吸附poly(A)的动态吸附性能比较(pH=7.0、0.6 mol⋅L−1 NaCl) Fig.4 Breakthrough curves of the NanoGel dT20 resin and dynamic poly(A) adsorption performance of the four affinity resins at different flow rates (pH=7.0, 0.6 mol⋅L−1 NaCl) |
由图 4(b)、(c)可见，NanoGel dT20和Monomix dT20这2种亲和层析介质对poly(A)的DBC10%值较高，且受流速影响较明显，DBC10%/Q随流速增加而大幅度下降。由前文可知，Monomix dT20的Q值比NanoGel dT20高，但图 4(b)显示DBC10%值却与NanoGel dT20接近，可能由于Monomix dT20介质的dpore相对较小，大部分poly(A)分子由于停留时间短、扩散传质阻力大等原因而未能扩散至介质微球内部孔中，仅在微球表层吸附，导致DBC10%没有明显高于NanoGel dT20；而且，随着流速增大，Monomix dT20介质中的poly(A)的扩散时间缩短，导致其DBC10%/Q大幅度下降。而NanoGel dT20仅依靠微球表层的poly(A)吸附就能达到较高的DBC10%值，这可能与其具有比Monomix dT20稍大的dpore、较小的扩散传质阻力、较大的可及吸附表面积有关，此外配基密度、配基长度和间隔臂等性质也会影响其DBC10%，该结果与3.3节的推论相符。至于NanoGel dT20的DBC10%/Q受流速影响较大，分析原因可能是由于介质配基密度较高，导致基球带电荷量较大，对poly(A)的静电排斥力更强，影响了配基对poly(A)的吸附动力学，故传质阻力更大，吸附所需时间更长。正如Vanjur等[31]报道，固定在表面的DNA探针密度会影响其与目标互补链的静电斥力，改变吸附平衡和吸附动力学。
由图 4(b)、(c)还可见，Praesto Jetted(dT)25和Poros Oligo (dT)25这2种亲和层析介质对poly(A)的DBC10%相对略低，这可能与其dpore较大导致的可及吸附表面积较小有关。由3.2节可知，Praesto Jetted(dT)25的Q值高于Poros Oligo (dT)25，但图 4(b)显示DBC10%值却较小，可能也是由于微球表面高配基密度影响了配基对poly(A)的吸附动力学。由图 4(c)可见，随着流速增加，这2种亲和层析介质的DBC10%/Q值变化幅度不大，表明传质阻力并没有随流速的增加而明显增加，推测是由于这2种亲和层析介质对poly(A)的吸附主要为表层吸附，扩散传质所占比例较小，总传质速率受流速影响较小。
由图 4(c)还可见，在低流速下(50 cm⋅h−1)，Poros Oligo (dT)25、Praesto Jetted(dT)25和NanoGel dT20这3种亲和层析介质的DBC10%/Q值都接近70%，且均高于Monomix dT20，表明这3种亲和层析介质的传质阻力较小、总传质速率较高，进一步推测，这3种亲和层析介质对poly(A)的吸附主要为对流传质主导的表层吸附，而Monomix dT20介质则主要为表层吸附和微球深层孔扩散吸附，与3.3节的结论一致。
3.5 CLSM结果及分析借助CLSM分析，从微观视角考察4种亲和层析介质微球中poly(A)的分布状态及其随时间变化情况，结果如图 5所示。结合此宏观吸附实验结果分析不同亲和层析介质的吸附特性。
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图 5 4种亲和层析介质吸附poly(A)随时间变化的CLSM结果 Fig.5 CLSM profiles of poly(A) adsorption as a function of time by the four affinity resins |
由图 5(a)~(c)可见，绿色荧光主要分布在介质微球表层，表明poly(A)主要吸附在Poros Oligo (dT)25、Praesto Jetted(dT)25和NanoGel dT20这3种亲和层析介质的外表层，且1 min之后荧光强度没有明显变化，与3.3节结果一致，可能原因是具有较大dpore的聚苯乙烯微球内部存在较多狭窄孔道，从而阻碍了poly(A)的微球内部孔扩散。对于Monomix dT20介质(见图 5(d))，随着吸附时间延长，荧光呈环状逐渐向内扩展，表明poly(A)逐渐扩散至微球内部；20 min后微球荧光强度分布基本稳定，达到吸附平衡，与3.3节的吸附动力学变化规律一致。
3.6 静态吸附容量理论计算及分析静态吸附容量是影响介质DBC的重要参数，为了更好地探究亲和层析介质载量的主要影响因素，对不同dp、dpore下亲和层析介质微球对mRNA的Qcal进行了理论计算及分析。
针对3种不同水力学直径的mRNA，在ε=0.4、m=0.6 mg⋅μL−1、CF=1.2条件下，且介质无孔，Qcal~dp的理论计算结果如图 6(a)所示。由图 6(a)可见，在dp=5~50 μm时，随着dp增大，Qcal下降，且Qcal值均小于3 mg⋅g−1，这是因为，对于无孔微球，mRNA仅存在表面吸附，dp越大，外表面积相对越小，从而导致较低的吸附容量。由图 6(a)还可见，mRNA的水力学直径很小时(10 nm)，Qcal值较大，这是因为，较小的mRNA分子占据空间小，同样的外表面积可吸附数量更多的mRNA分子，从而Qcal值较大。由图 6(a)的Qcal值可知，仅靠介质微球的表面吸附无法达到较高的mRNA静态吸附容量。
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图 6 介质微球的dp和dpore对mRNA的Qcal影响的理论计算结果 Fig.6 Theoretical Qcal calculation results for mRNA in resins with different dp and dpore |
对于多孔亲和层析介质，假设εp= 0.5、mRNA分子均能扩散进入孔内且占据所有孔内表面，以dp=30 μm的微球为例，微球内、外表面对mRNA的Qcal~dpore理论计算结果如图 6(b)所示；针对3种不同水力学直径的mRNA，Qcal~dpore理论计算结果如图 6(c)所示。由图 6(b)可见，dpore=100~1 000 nm时，多孔介质微球的Qin是Qex的10~100倍，因此，增加微球内孔的可及吸附表面积对提升介质微球对mRNA的静态吸附容量至关重要。由图 6(c)可见，随着dpore增大，Qcal下降显著，较大的mRNA分子(30 nm和40 nm)在介质中的Qcal=1~14 mg⋅g−1，而最小的mRNA分子(10 nm) Qcal=4~35 mg⋅g−1。这是因为，dpore对介质的可及吸附表面积影响较大，dpore增大时，会导致介质微球可及吸附表面积变小，从而导致Qcal值变小。在实际吸附过程中，mRNA分子并不能扩散进入介质微球孔内，孔内的可及吸附表面积还与mRNA分子大小有关，dpore过小时，因大分子的mRNA孔扩散传质受到阻碍，可及吸附表面积减小，从而导致Qcal值减小。因此，针对不同大小的mRNA分子应定制不同孔径的微球，以达到较大的静态吸附容量和动态结合载量。
4 结语(1) 以poly(A)为模型分子，考察了4种Oligo(dT)亲和层析介质对poly(A)的吸附特性，发现最佳吸附条件均为高盐浓度和pH=6~7；
(2) 4种介质中，Monomix dT20介质的静态吸附容量最大，且poly(A)能扩散至其深层孔内，而其他3种介质中poly(A)均主要为表层吸附，静态吸附容量稍低，与CLSM荧光分布结果一致，这可能与基质材料有关。然而，Monomix dT20介质的DBC10%相对并不显著的大，可能是由于其dpore相对较小导致扩散传质阻力较大；
(3) NanoGel dT20介质与Monomix dT20介质相比，dpore稍大，扩散传质阻力小，可及吸附表面积大，两者对poly(A)的DBC10%值接近，均较高；而Poros Oligo (dT)25和Praesto Jetted(dT)25这2种介质的dpore偏大，可及吸附表面积偏小，DBC10%相对略低；
(4) 比较不同亲和层析介质的吸附特性，影响载量的主要因素有基质种类和dpore，其他因素包括配基密度、间隔臂、配基长度等。对于基质种类，聚苯乙烯基质可能孔道结构较为特别，内部存在较多狭窄孔道，导致孔扩散吸附较少，降低了Qm，但其对DBC的影响有待进一步探究；对于dpore，需要针对不同大小的mRNA分子定制不同孔径的微球，以平衡扩散传质阻力与可及吸附表面积之间的矛盾，从而有效增大静态吸附容量和动态结合载量。此外，由于本研究使用的poly(A)分子直径较小，与长链mRNA的吸附行为可能存在一定差异，相关影响有待深入研究。
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