酶在有机与生物合成中是一类重要的催化剂，因其具有高选择性、反应条件温和、环境友好、副产物少等优点，被广泛应用于医药、化工、食品、纺织、洗涤剂及能源等工业领域^[1~4]。脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3)主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶，广泛存在于动植物和微生物体中^[5]，已成功应用于Aldol缩合、Knoevenagel缩合、Michael加成、Henry反应等多种C-C键形成反应^[6~8]。

Aldol缩合被认为是有机化学中最重要的C-C键形成反应之一^[9]，可用于多种天然或非天然有机化合物的合成中。在有机合成中有许多关于用酸^[10]、碱^[11]、有机小分子^[12]催化的Aldol缩合报道，但发现来源更广泛、成本更加低廉、更加绿色高效的新型Aldol缩合反应催化剂仍然具有重要意义。2003年，Branneby等^[13]首次发现了脂肪酶具有催化Aldol缩合反应的活性，他们用天然南极假丝酵母脂肪酶(Candida antarctica lipase, CALB)催化此反应，但仅限于丙醛和己醛等简单的脂肪醛且收率只有6%~12%。Li等^[14]报道了水相中猪胰脂肪酶(Porcine Paoceneas Lipase, PPL)催化的不对称Aldol反应并提出了反应机理，收率为11.7%~96.4%，ee值为9.6%~43.6%，然而论文仅考察了硝基取代的苯甲醛与丙酮的反应。Guan等^[15]发现PPL能催化杂环酮与各种有吸电子取代基的芳醛的不对称Aldol反应，在乙腈溶剂中反应120 h以上，最高收率为56%，此时ee值为46%。Xie^[16]等发现了在酸性缓冲溶液中牛胰脂肪酶(bovine pancreatic lipase，BPL)能催化多种芳香醛与环酮类化合物的不对称Aldol反应，但该法不能应用于直链酮底物，如与丙酮反应时，反应没有选择性，收率仅为26%。

研究表明在酶催化反应中加入合适的有机小分子作为添加剂，可以改善酶的催化性能。Itoh等^[17]研究了洋葱假单胞脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase，PCL)催化2-氰基-1-甲基-乙酸乙酯的水解反应中，加入冠醚可以显著的改变其反应速率和立体选择性。Liu等^[18]报道了在褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase, CRL)催化酮洛芬酯的水解反应时，加入8%(w/v)吐温80可以使酶活性提高13倍，对映体选择率E值从1.2提高到6.7。Chen等^[19]研究了N-杂环化合物添加对酶促反应的调控作用，发现咪唑可以促进D-氨基酰化酶(D-aminoacylase, DA)催化的Claisen-Schmidt反应。

Lipase lipoprotein脂肪酶(LPL)来源于黑曲霉，相比与BPL、CALB等成本要低得多。本文首先以对硝基苯甲醛与丙酮的Aldol缩合反应为模型，考察了添加剂种类和添加量、水含量、时间、温度等因素对反应的影响(Scheme 1)，并对反应底物的适用范围进行了研究，希望发展一种成本更低、效率更高、底物适应范围更宽的绿色Aldol缩合反应新方法。

图式1(Scheme1)

图式1 LPL催化4-硝基苯甲醛与丙酮Aldol缩合反应 Scheme1 Aldol condensation of acetone and 4-nitrobenzaldehyde catalyzed by LPL

Lipase lipoprotein脂肪酶(LPL)购自宁夏夏盛实业集团有限公司，其它药品和试剂均为市售分析纯。熔点测定使用WRS-1B数字熔点仪，温度未经校正；核磁共振用BRUKERAC-P400型仪测定。

将2 mmol对硝基苯甲醛和1 mL去离子水、2.3 mL丙酮加入10 mL反应瓶中，然后加入0.2 g LPL、60%(mol)咪唑，35℃下搅拌反应，TLC(石油醚/乙酸乙酯1/1，v/v)监测反应进行情况，反应完毕后过滤除酶，滤纸和滤液分别用CH₂Cl₂和水洗涤三次^[16]。滤液用无水MgSO₄干燥后过滤，减压旋蒸，粗产物经柱层析[石油醚/乙酸乙酯，9/1~2/1，v/v]分离即可得到纯化的目标产物。

(3i)¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.23 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.64~7.46 (m, 2H), 5.48 (s, 0.68H), 4.97 (d, J=7.6 Hz, 0.28H), 4.18 (s, 1H), 3.83 (d, J=12.4 Hz, 1H), 3.27 (s, 2H), 2.75 (s, 1H), 2.51 (dd, J=10.1, 5.8 Hz, 2H), 1.38 (t, J=20.0 Hz, 10H)。

(3j)¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.22 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.52 (d, J=8.6 Hz, 2H), 5.54 (s, 0.67H), 5.00 (d, J=8.1 Hz, 0.38H), 4.29~4.16 (m, 1H), 3.85 (dd, J=6.4, 1.3 Hz, 1H), 3.82~3.68 (m, 2H), 3.46 (dd, J=11.4, 9.9 Hz, 0.38H), 3.04 (s, 0.61H), 2.93 (dd, J=5.7, 4.8 Hz, 1H), 2.80~2.63 (m, 1H), 2.58~2.45 (m, 1H)。

从表 1中可以看出添加剂的选择对于LPL催化Aldol反应有着重要的影响，当加入咪唑类添加剂时对反应有明显的促进作用，如以咪唑为添加剂时(Entry 5)，反应48 h后，收率可达71.6%。而18冠醚-6、β-环糊精以及表面活性剂不能辅助LPL催化Aldol反应(Entry1-3)。对比单独以LPL和咪唑为催化剂时反应的收率(Entry6~7)，可以看出咪唑添加剂与LPL对此反应具有显著的协同催化作用，这与Chen等^[19]报道的结果相似。

表 1(Tab. 1)

表 1 不同种类添加剂对LPL催化4-硝基苯甲醛与丙酮Aldol缩合反应的影响 Table 1 Effects of different additives on the Aldol condensation of acetone and 4-nitrobenzaldehyde catalyzed by LPL Entrya Additive Yield/% b 1 18-Crown-6 6.4 2 β-cyclodextrin 9.6 3 Tween-80 12.6 4 N-methylimidazole 66.9 5 Imidazole 71.6 6 Nonec 19.8 7 Blankd 25.9 8 Blanke N.R a Reaction conditions: LPL (0.2 g), (30%(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone (2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃, reaction time (48 h);b Isolated yield;c Without additive, LPL (0.2 g);d Without LPL, 30 %(mol) imidazole;e Without LPL, without additive.

表 1 不同种类添加剂对LPL催化4-硝基苯甲醛与丙酮Aldol缩合反应的影响 Table 1 Effects of different additives on the Aldol condensation of acetone and 4-nitrobenzaldehyde catalyzed by LPL

图 1考察了水含量为30%时，添加剂咪唑用量对反应的影响。随着咪唑用量的增加，该反应的产物收率也逐渐增加。当咪唑用量达到60%(mol)时，收率达到最大，此时再增加咪唑用量，产物收率基本不变。在此反应条件下，单独用60%(mol)咪唑催化收率仅为40%，再次证明了咪唑与LPL共同作用催化了Aldol缩合。因此，本文选择咪唑用量为60%(mol)对反应进行后续探讨。

图 1(Fig. 1)

图 1 咪唑添加量对Aldol反应收率的影响 Fig.1 Effect of additive loading on the reaction yield of Aldol condensation Reaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (0~70 %(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone (2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃, reaction time (48 h). Isolated yield after silica gel chromatography

反应中水含量会影响酶的活性中心、稳定性，甚至引起酶分子三维构象发生改变^{[20, 21]}，因此体系中水含量是影响反应的重要因素之一。图 2考察了水含量对反应的影响。如图所示水含量对反应的影响较大——不加水时，反应基本不进行，产物收率仅为0.9%；随着反应体系中水含量的增加，产物收率也逐渐的提高，在水含量为30%(v/v)时，收率达到92.7%；继续提高反应体系中的水含量，产物收率会逐渐下降，可能是反应体系中过多的水导致底物的溶解度降低。因此，本文选择最佳水含量为30%(v/v)。

图 2(Fig. 2)

图 2 水含量对Aldol反应收率的影响 Fig.2 Effect of water content on the reaction yield of Aldol condensation Reaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (60 %(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone(2.3 mL, deionized water(H2O/(H2O+CH3COCH3=0-50%, v/v), 35℃, reaction time (48 h). Isolated yield after silica gel chromatography

通常，反应温度对酶的活性构象、催化活性和稳定性有较大的影响^[22]。由图 3可见，在一定的温度范围内，随着温度的升高，反应收率会增加；当温度高于35℃时，收率会随温度的升高而降低，这是由于在较高温度下使酶发生变性导致。

图 3(Fig. 3)

图 3 温度对Aldol反应收率的影响 Fig.3 Effect of temperature on the reaction yield of Aldol condensation Reaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (60 %(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone(2.3 mL), deionized water 1 mL, reaction time (48 h). Isolated yield after silica gel chromatography

图 4考察了反应时间对反应收率的影响。由图可见产物收率随反应时间的增加而升高；反应进行到48 h时，反应基本达到平衡，收率为92.7%，再延长反应时间，产物收率基本不变。

图 4(Fig. 4)

图 4 时间对Aldol反应收率的影响 Fig.4 Effect of reaction time on the yield of Aldol condensation Reaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (60 %(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone(2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃. Isolated yield after silica gel chromatography

图式2(Scheme2)

图式2 LPL催化芳醛与酮类化合物Aldol缩合反应 Scheme2 LPL-catalyzed Aldol condensation of ketones and other aromatic aldehydes

综合以上实验结果，得到优化后的条件：水含量为30%(v/v)，添加剂咪唑为60%(mol)，催化剂LPL用量为0.2 g，在此条件下在35℃反应48 h，对硝基苯甲醛与丙酮的Aldol缩合反应收率可达92.7%。

在优化的反应条件下，对底物进行了扩展，结果见表 2。从实验结果可以看出，对于芳香醛来说，取代基的电子效应对反应有着显著的影响。当取代基为强吸电子的4-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛及2-硝苯甲醛时，收率分别为92.7%、90.6%、87.2%(表 2, 3a~3c)；而具有相对吸电子效应较弱基团的对氰基苯甲醛、2, 4-二氯苯甲醛和丙酮反应时，收率分别为60.1%，68.6%(表 2, 3d、3e)。除此之外，还发现不同结构的直链酮、环酮以及四氢吡喃酮、四氢噻喃-4-酮等杂环酮与4-硝基苯甲醛在此反应条件下也能获得较好的收率(表 2，3f~3k)。

表 2(Tab. 2)

表 2 LPL催化芳醛与酮类化合物Aldol缩合反应 Table 2 LPL-catalyzed Aldol condensation of ketones and other aromatic aldehydes Compd. R1 Ketone Product Yield/% b Melting point/℃ Observed Reported 3a p-NO2 92.7 61~62 61~63[23] 3b o-NO2 87.2 61~62 65~68[24] 3c m-NO2 90.6 49~50 50~52[25] 3d p-CN 60.1 51~53 53~54[26] 3e o, p-Cl 68.6 53~54 53~54[25] 3f p-NO2 88.4 81~84 89~91[27] 3g p-NO2 87.3 144~145 138~140[28] 3h p-NO2 73.3 147~148 150~151[29] 3i p-NO2 81.4 103~107 not reported 3j p-NO2 79.3 130~133 not reported 3k p-NO2 51.8 135~138 140~141[30] a Reaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (60 %(mol)), aromatic aldehyde (2 mmol), ketone (2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃, reaction time (48 h). b Isolated yield after silica gel chromatography.

表 2 LPL催化芳醛与酮类化合物Aldol缩合反应 Table 2 LPL-catalyzed Aldol condensation of ketones and other aromatic aldehydes

为了凸显本方法的催化效率，以对硝基苯甲醛与丙酮以及环己酮的反应为代表，与文献报道的方法作对比，反应时间得到大幅度减少，且不需要调控pH或加入乙腈等其他有机溶剂，结果见表 3。

表 3(Tab. 3)

表 3 不同种类酶催化的Aldol缩合 Table 3 Aldol condensation catalyzed by different enzymes Product Yields/% Product Yields/% This work Literature This work Literature 3a 93 12[31a] 3 h 73 37[32] 32[14] 69[31b] 26[16] 60[33] Note: Yield for reaction catalyzed by PPL at 30℃ for 48 h [14]. Yield for reaction catalyzed by BPL at 30℃, pH 5.6 for 108 h [16].a. Yield for reaction catalyzed by chymopapain at 30℃, pH 4.91 for 120 h in MeCN;b. Yield for reaction catalyzed by chymopapain at 30℃, pH 4.91 for 240 h in MeCN [31]. Yield for reaction catalyzed by pepsin at 30℃ for 96 h [32]. Yield for catalyzed by trypsin at 30℃ for 144 h in water [33]

表 3 不同种类酶催化的Aldol缩合 Table 3 Aldol condensation catalyzed by different enzymes

研究首次发现了脂肪酶LPL与咪唑协同作用下，可以高效地催化吸电子取代的芳香醛与脂肪酮、环酮、杂环酮等不同结构酮的Aldol缩合反应。相比文献报道的BPL、CALB等其他种类的脂肪酶，LPL成本更加低廉，且具有环境友好、底物适用范围广、产率高、反应时间短等优点。