2. 浙江大学 生物质化工教育部重点实验室，浙江 杭州 310027
2. Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China
从植物油的加工副产物(脱臭馏出物)中，通过提取可以得到一些结构相近的植物甾醇同系物，可广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品等领域。例如，豆甾醇具有很高的药用和经济价值，可作为生产甾体药物关键中间体雄甾二烯二酮(4AD)的主要起始原料，也可用作无刺激保湿剂、乳化助剂及调理剂等；β-谷甾醇能明显降低血清胆固醇，可转化成药用维生素D3原料以及多种甾体激素，也可取代胆甾醇作为脂质体膜材。豆甾醇和β-谷甾醇的分子结构见图 1。
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图 1 豆甾醇和β-谷甾醇的分子结构 Fig.1 Molecular structures of stigmasterol and β-sitosterol |
甾醇同系物分子的结构差异很小，但其生物活性却相差很大，例如β-谷甾醇具有明显的抗炎性，而豆甾醇则具有一定的表面活性作用。由于β-谷甾醇和豆甾醇结构差异仅在于侧链双键，具有较大的分离难度，至今没有一项适于工业化的技术(如溶剂结晶法、固定床吸附法和传统液-液萃取法)能把植物甾醇的分离成本控制在可接受的范围，通过多次结晶或萃取等操作得到的产品仍达不到高纯度要求。例如，万建春等采用结晶法提纯豆甾醇和β-谷甾醇，经4次结晶操作后才使β-谷甾醇的纯度达到90%[1]；现有的有机溶剂种类有限，传统液-液萃取法选择性较低，达到分离要求需要多次单级萃取或使用多级逆流萃取工艺，操作费用大；利用碱性阴离子交换树脂吸附分离，具有较高的选择性，但存在溶剂消耗量大而传质慢、处理量小等问题，难以满足工业化大规模生产。近年来的研究结果表明，离子液体具有独特的理化性质，能克服传统溶剂的缺点，萃取效率显著提高[2]，对结构相似物的分离表现出优异的分离选择性[3-6]。考虑工业生产的需要，本文选用技术成熟、成本较低的N, N′-二烷基咪唑盐类离子液体，通过真实溶剂似导体屏蔽模型(conductor-like screening model for real solvents, COSMO-RS)预测[7-14]，筛选出高选择性的离子液体，构建离子液体液-液两相体系，结合高效液相色谱(HPLC)分析方法测定植物甾醇的分配系数和分离选择性，得到合适的复合萃取剂，实现植物甾醇高选择性分离。
2 COSMO-RS预测首先，使用Gaussian 09程序包对化合物分子的几何构型精确优化，采用密度泛函理论(DFT)，在B3LYP/6-31G (d, p)水平下得到最低能量的稳定结构。然后，使用Turbomole 2011程序包[15]，采用RI-DFT方法，在Ahlrichs-TZVP水平下得到分子的能量和分子表面屏蔽电荷密度，以及每个分子的σ-profile。最后，通过COSMO therm 2011程序包[16]，使用参数文件BP_TZVP_C30_1201.ctd计算离子液体与甾醇同系物的相互作用，从而筛选出高选择性离子液体复合萃取剂。
3 实验 3.1 实验原料和仪器植物甾醇标样和粗品(标样购自百灵威科技有限公司，粗品为实验室自制，经HPLC测定豆甾醇≥36%，β-谷甾醇≥42%)；离子液体([bmim]Cl，≥99 %)，购自上海艾科股份有限公司，使用前由卡尔费休水分测定仪测得水份含量低于0.3 %；其余试剂如正己烷、甲醇、正丁醇、乙腈等均为分析纯，购自杭州汇普化工仪器有限公司。
Waters液相色谱仪(美国Waters公司)，DSHZ-300A振荡水浴槽(苏州培英实验设备有限公司)，AS20500A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，AL204101电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，ZKF-1型卡尔费休水分测定仪(上海市隆拓仪器设备有限公司)。
3.2 实验方法将一定量的甾醇原料溶于正己烷中配成原料液，然后将此正己烷溶液与相同体积的离子液体复合萃取剂加入到10 mL具塞锥形瓶中，密封。将装有液-液两相体系的锥形瓶置于恒温振荡器中，在设定温度(℃)下200 r.min−1振荡数小时(每隔5 min取样分析，确定萃取平衡的时间为10~20 min。因此，本文选取两相的振荡时间为3 h，确保体系达到充分的萃取平衡)，然后在相同温度下静置2~3 h。待两相彻底分离后，用预先保温的移液管分别从上下两相取样1 mL至容量瓶中，由甲醇稀释定容至刻度。最后用HPLC对样品进行分析。每组数据重复3次，取平均值。
通过实验确定HPLC的分析条件：色谱柱为C18反相柱(46 mm×250 mm，粒径5 μm)，柱温35℃，流速1.2 mL·min−1，纯甲醇为流动相，紫外检测波长210 nm，进样体积为10 μL。配制不同浓度的甾醇标样，得到标准曲线。分配系数D为甾醇在萃取相中的浓度除以萃余相中的浓度得到，见式(1)；豆甾醇对β-谷甾醇的分离选择性S由豆甾醇的分配系数除以β-谷甾醇的分配系数得到，见式(2)。
| $ {D_{{\text{stig}}}} = \frac{{C_{_{{\text{stig}}}}^{^{{\text{ext}}}}}}{{C_{_{{\text{stig}}}}^{^{{\text{raff}}}}}}~~~~~~{D_{{\text{beta - stio}}}} = \frac{{C_{_{{\text{beta - stio}}}}^{^{{\text{ext}}}}}}{{C_{_{{\text{beta - stio}}}}^{^{{\text{raff}}}}}} $ | (1) |
| $ {S_{{\text{stig/beta - sito}}}} = \frac{{{D_{{\text{stig}}}}}}{{^{}{D_{{\text{beta - sito}}}}}} $ | (2) |
式中，Dstig和Dbeta-stiO表示的分别是豆甾醇和β-谷甾醇的分配系数，ext表示萃取相，raff表示萃余相。
4 结果与讨论 4.1 COSMO-RS预测298.2 K，COSMO-RS预测豆甾醇在10种有机溶剂和10种具有不同氢键碱性阴离子1-丁基-3-甲基咪唑类离子液体中的溶解度及极性、氢键、范德华等作用力，结果见表 1。
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表 1 298.2 K下COSMO-RS预测豆甾醇在溶剂中的溶解度及极性、氢键、范德华等相互作用 Table 1 COSMO-RS predicted values of solubility and corresponding interaction energies for stigmasterol in solvents at 298.2 K |
从表 1可知，豆甾醇在10种有机溶剂中的溶解度受范德华相互作用(Evan der Waals)的影响较小，主要由Misfit相互作用(EMisfit)和氢键相互作用(EH-bonding)共同决定。在极性溶剂DMSO、1, 4-二氧六环、乙酸乙酯、丁酮中豆甾醇的溶解度相对较大，在正己醇、正丁醇、乙醇中氢键对溶解度的影响也不容忽视，且溶解度随EH-bonding的增强呈整体升高趋势。由表 1数据可见，豆甾醇在10种传统有机溶剂中溶解度都不是很大，尤其在乙腈和正己烷中非常小，限制了萃取的容量。
由表 1知，豆甾醇在10种离子液体中的溶解度受Misfit相互作用(EMisfit)和范德华相互作用(Evan der Waals)的影响较小，而与氢键相互作用(EH-bonding)呈现较大的相关性。究其原因，前者可能是由于咪唑类离子液体的偶极矩(Kamlet-Taft参数，π)差别较小，后者也许是豆甾醇分子中具有弱酸性的酚羟基，易与碱性较强的离子液体形成氢键的缘故。例如，[Bmim]Cl、[Bmim]MeCO2、[Bmim]EtCO2的Kamlet-Taft参数(β)分别为0.84、1.05和1.16，具有较强的氢键碱性，导致豆甾醇在上述离子液体中的溶解度(xcal)较大(依次为2.241、2.788、和3.067)。其它离子液体的氢键碱性(β)均远小于常规溶剂(甲醇、丙酮等)，与乙腈(β为0.370)接近，故溶解度很小。由此可以预测，氢键碱性较强的离子液体将增加萃取剂的萃取容量，萃取分离豆甾醇的效果会更好。
表 2列出了二种甾醇的分子量、分子体积及COSMO-RS分子描述符Sig 2，
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表 2 豆甾醇和β-谷甾醇的COSMO-RS分子描述符(Sig 2, HB_acc3和HB_don3) Table 2 COSMO-RS descriptors of Sig 2, HB_acc3 and HB_don3 for stigmasterol and β -sitosterol |
HB_acc3和HB_don3。其中，Sig2表示极性或极化；HB_acc3为氢键受体，表示氢键碱性；HB_don3为氢键供体，表示氢键酸性。从表 2可以看出，β-谷甾醇分子量稍大，与溶剂分子产生相互作用比豆甾醇略大，但豆甾醇的分子极性很明显高于β-谷甾醇，氢键相互作用稍高于β-谷甾醇，其原因可能是豆甾醇分子有一个双键，而后者没有。由此可以预测，使用极性较强的离子液体萃取剂有望取得更好的分离效果，萃取剂极性增大，与豆甾醇的亲和力也会增大，易形成萃取相分离。
4.2 萃取分离效果根据以上COSMO-RS预测，实验筛选离子液体[bmim]Cl为代表，复配离子液体-分子溶剂混合物。由于甾醇分子极性较弱，因此，选取弱极性溶剂正己烷，构建[bmim]Cl -正丁醇/正己烷和[bmim]Cl -乙腈/正己烷三元两相体系，考察了离子液体复合萃取剂对豆甾醇的萃取效果，图 2画出了稀释剂种类、离子液体浓度对豆甾醇分配系数D、豆甾醇对β-谷甾醇萃取选择性S的影响(30℃)。
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图 2 稀释剂种类、离子液体浓度对豆甾醇分配系数(D)、豆甾醇对β-谷甾醇萃取选择性(S)的影响 Fig.2 Effects of diluents and ionic liquid concentrations on distribution coefficient (D) and separation selectivity (S) |
由图 2可见，[bmim]Cl -乙腈作萃取剂随离子液体浓度的增加，豆甾醇分配系数增大，仅加入1%摩尔分数的[bmim]Cl，分配系数即从1.34上升到6.6，之后缓慢增加，至20%~30%达到最大，达7.7左右；[bmim]的Cl摩尔分数继续增加，分配系数反而下降。萃取选择性系数与分配系数有相同的变化趋势，但变化更显著，当[bmim]Cl的摩尔分数为20%时，选择性可达65.8，是纯乙腈的54倍。这可能是因为离子液体的摩尔分数增大，其氢键碱性参数β值增大[19]，可能使得复合萃取剂的极性增大，从而与豆甾醇的亲和力增大，实验结果与COSMO-RS预测相吻合。当离子液体摩尔分数大于30%，分配系数变化不大，但选择性开始下低，这可能是因为离子液体体系的黏度增大，使传递过程减慢，从而降低了萃取分离效果。
从图 2还获悉，正丁醇与离子液体组成混合萃取剂后，分配系数随离子液体浓度的增加而增加，离子液体的加入，提高了豆甾醇的分配系数，但萃取选择性并没有显著变化，萃取效果并不好，说明正丁醇不适合作该萃取体系的稀释剂。这可能是植物甾醇是弱极性疏水性物质，而离子液体是一种强极性的亲水物质，只有加入像乙腈一类极性相对较小的稀释剂，才可能对植物甾醇的溶解性取到较好调控。因此，虽然离子液体本身有可调性，但只有引入合适的稀释剂才可起到双重调节，才可进一步提高萃取分离效果。
实验结果表明，[bmim]Cl -乙腈/正己烷三元两相体系的互溶程度，明显低于[bmim]Cl -正丁醇/正己烷体系，即使随着[bmim]Cl摩尔分数的增加也是如此。因此，构建不互溶的液-液两相体系有利甾醇同系物的萃取分离。实验还考察了不同温度(30、40、50℃)下, 20% [bmim]Cl -乙腈复合萃取剂对豆甾醇的萃取效果(如表 3所示)。从表 3看出，分配系数和选择性系数都随温度的升高而下降，这可能是随着温度的升高，液-液两相体系的互溶度增大。因此，常温下进行萃取分离实验是可行的。
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表 3 温度对豆甾醇萃取分离的影响 Table 3 Effects of temperature on stigmasterol extraction |
图 3为[bmim]Cl -乙腈复合萃取剂分离前后的豆甾醇HPLC图。图中，A为植物甾醇原料HPLC图(1为豆甾醇吸收峰，2为β-谷甾醇吸收峰)；B为摩尔分数为20%的[bmim]Cl -乙腈萃取剂15 min后得到豆甾醇HPLC图。
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图 3 离子液体复合萃取剂萃取分离前(A)、后(B)的豆甾醇HPLC谱图 Fig.3 HPLC spectra of phytosterols before (A) and after (B) separation by ionic liquid composite extractants (1 for stigmasterol; 2 for β-sitosterol) |
由图 2和图 3所知，用摩尔分数为20%的[bmim]Cl-乙腈作萃取剂分离植物甾醇有较好的萃取性能，从图 3B可见，用20% [bmim]Cl-乙腈萃取15 min后得到的产物几乎是豆甾醇。最后，通过向萃取相中添加正己烷进行反萃取回收，豆甾醇的纯度可达98.3%，经蒸馏，回收离子液体重新利用。
5 结论采用COSMO-RS模型预测了豆甾醇在10种有机溶剂和10种离子液体中的溶解特性及多重相互作用，预测结果表明，豆甾醇在有机溶剂中的溶解度主要由极性和氢键相互作用共同决定，其溶解度都比较小，限制了萃取容量；在离子液体中的溶解度随氢键相互作用的增强而增大，氢键碱性较强的离子液体将增加萃取剂的萃取容量。实验筛选出以[bmim]Cl离子液体为代表，构建了[bmim]Cl -正丁醇/正己烷和[bmim]Cl -乙腈/正己烷两相体系，考察了离子液体复合萃取剂对豆甾醇的萃取效果，实验结果表明：[bmim]Cl -正丁醇/正己烷两相体系并不适用于植物甾醇同系物的萃取分离；[bmim]Cl -乙腈/正己烷两相体系是合适的萃取体系，随[bmim]Cl浓度的增加，分配系数和萃取选择性系数的增加十分显著，当[bmim]Cl的摩尔分数为20 %时，豆甾醇的分配系数可达7.89，豆甾醇对β-谷甾醇的分离选择性可达65.8，是纯乙腈为萃取剂时的54倍。通过反萃回收，得到的豆甾醇纯度可达98.3 %。
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