漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可催化氧化酚类、芳胺、羧酸及它们的衍生物，有些漆酶甚至可催化氧化非苯环类物质，由于其可降解的底物的多样性，成为众多研究的焦点。其应用范围包括染料脱色、纸浆漂白、废水解毒、生物传感器和生物修复等方面[1]。由血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)产生的漆酶耐热性能良好，具有重要工业应用价值[2]，但该菌的产酶性能低，不适于规模化生产，而且由于此菌产生的漆酶同工酶大小相近，不易分离。将外源漆酶基因转入其他宿主菌中进行高效表达不仅可以实现漆酶工业化应用，还可以轻松从多种同工酶中分离出性能更好的漆酶[3]。
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种常用的丝状真菌表达宿主，其含有强启动子Pcbh 1，能够实现外源基因的高效表达[4]，它不仅具有良好的蛋白合成和胞外分泌的能力，而且还拥有与高等生物相似的糖基化系统，已成功应用于多种酶蛋白基因的表达[5]。众所周知，漆酶可以用来降解木质素，里氏木霉能产生大量的纤维素酶，常见的生物质原材料如玉米秸秆和稻草秸秆等都含有较高量的木质素和纤维素，把漆酶基因转入里氏木霉中进行表达可能产生对生物质利用更充分的菌种。本文将血红密孔菌的漆酶基因经过密码子优化后，通过农杆菌介导技术导入里氏木霉宿主细胞中，以期得到可以产漆酶的里氏木霉。
活性艳蓝KN-R(Reactive Brilliant Blue KN-R；Reactive Blue 19)是一种典型的蒽醌类染料，溶液为蓝色，常用于棉、黏胶、麻、蚕丝和棉化织物的染色和印花，在纺织染整工业中应用极为广泛。但活性艳蓝KN-R也是一种对人体和环境有害的有机化合物，此类染料由于含有共轭结构，通常很难降解[6]。染整领域产生的含活性艳蓝KN-R的印染废水数量巨大，对江河、土壤及地下水资源的污染严重，急需加以脱色治理。据文献报道活性艳蓝KN-R在经过漆酶脱色后，其毒性明显降低[7]。本文采用重组里氏木霉所产的漆酶，对含活性艳蓝KN-R印染废水进行脱色试验，旨在促进漆酶在环境治理[8]中的规模化应用。
2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌株大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) AGL-1均为本实验室保存菌株[9, 10]。
2.1.2 酶与质粒实验所需的限制性核酸内切酶及T4连接酶均购自Takara公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pCB-h、pUC18-PsT为实验室现有的载体质粒。
2.1.3 含活性艳蓝KN-R印染废水取自浙江绍兴某染整厂，外观为深蓝色，pH在4~5，COD值为14380 mg·L-1，色度为24000，活性艳蓝KN-R浓度测得为64.5 mg·L-1。
2.2 培养基 2.2.1 种子培养基葡萄糖10 g·L-1，酵母粉9 g·L-1，(NH4)2SO4 5 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.5 g·L-1，KH2PO4 10 g·L-1。
2.2.2 产酶培养基乳糖40 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，酒石酸铵2.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1，CaCl2·2H2O 0.8 g·L-1，KH2PO4 4 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.25 g·L-1，VB1 1 mg·L-1；
2.3 重组质粒pCH-lac的构建从基因文库中调取耐热真菌Pycnoporus sanguineus的漆酶基因序列，按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，优化后的序列GC含量为66.9 %。XhoⅠ和XbaⅠ的酶切位点分别添加到在优化后的基因两端，此漆酶基因利用ABI 3900型高通量DNA合成仪进行，然后与高效克隆PCR产物的专用载体pMD-18T质粒相连得到pMD-lac质粒。
用XhoⅠ和XbaⅠ限制酶分别双酶切质粒pUC18-PsT[11]和pMD-lac，其质粒中pUC18-PsT含有里氏木霉强启动子Pcbh1、信号肽ss和终止子Tcbh1，再用T4连接酶连接，得到中间质粒pCB-lac。
采用BamHI和SpeⅠ限制酶对pCB-h[11] (含有潮霉素抗性标记)和pCB-lac进行双酶切，后用T4连接酶连接组成最终的重组转化质粒pCH-lac (图 1)。
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图 1 重组质粒pCH-lac Fig.1 Recombinant plasmid pCH-lac |
在大肠杆菌中高拷贝复制后利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒后进行酶切验证。体系为：重组质粒10 μL，缓冲液2 μL，限制性核酸内切酶SpeⅠ和BamHI各1 μL(单酶切时只需加入1 μL的BamHI)，无菌水20 μL。反应1.5 h后，进行琼脂糖凝胶电泳，40 min后紫外灯下检测。
2.4 根瘤农杆菌介导转化里氏木霉首先采用冻融法将重组质粒pCH-lac转入根瘤农杆菌AGL-1，再利用农杆菌介导技术将目的基因转入里氏木霉。具体操作详见参考文献[12]。
2.5 重组里氏木霉转化子的复筛利用切割器在刚长出的转化子菌落上切取直径为0.3 cm的菌块，转移到加有潮霉素和头孢霉素的PDA筛选平板上进行培养，定期观察菌块生长情况、将生长快的转化子挑选出来进行后期的产酶试验。
2.6 重组子的产酶试验产酶试验在250 mL摇瓶中进行，装液量50 mL。将重组转化子和里氏木霉出发菌株接种到种子培养基中，30℃、180 r·min-1摇瓶培养48 h后，以10 %(V/V)的接种量转接至产酶培养基，在30℃、180 r·min-1的摇瓶培养产酶。
补料培养在上述批式发酵基础上进行：分别在发酵48、72、96、120 h，补加0.5 % (w/v)的乳糖。定期取样检测发酵液中的漆酶活力、pH值及还原糖含量。
2.7 漆酶对含有活性艳蓝KN-R染料废水的脱色首先将废水水样进行自然沉淀，再在4000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液进行脱色实验。脱色实验：在100 mL的摇瓶中加入含有活性艳蓝KN-R染料的废水30 mL。漆酶用量为0.7 IU·mL-1，在特定pH值(3.2~4.2)、特定温度(35~65℃)、摇床转速100 r·min-1条件下，进行脱色反应，每隔1 h取样测定。
2.8 测定方法漆酶活力测定：以ABTS (2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为底物，在30℃、pH 4.0的反应体系内测定上清液前两分钟在420 nm处吸光度的变化值。具体操作时先将50 µL适当稀释的酶液加入到950 µL pH 4.0柠檬酸缓冲液中，然后与1 mL ABTS溶液混合均匀后再测量吸光值的变化。每分钟消耗1 µmol ABTS定义为一个漆酶活力单位(IU·mL-1)[13]。
还原糖浓度：采用3, 5-二硝基水杨酸法，利用在一定范围内，还原糖与3, 5-二硝基水杨酸法生成的棕红色物质颜色深浅程度与还原糖的量成正比关系的原理进行测试。具体操作参照文献使用的方法[14]。
脱色率测定：活性艳蓝KN-R最大吸收波长在595 nm，一定范围内，此波长下的吸光值与其浓度成正比，所以可以通过测量吸光值测定浓度。配制25~200 mg·L-1的活性艳蓝KN-R，测量其在595 nm下的吸光值，作出标准曲线。在595 nm下测定脱色反应取出样的吸光值，脱色率按以下公式计算：脱色率(%) =(A0-A1)/A0×100%。其中A0为废水在脱色反应前的吸光值，A1为废水经脱色反应一段时间后溶液的吸光值。
3 结果与讨论 3.1 重组质粒pCH-lac的验证分别利用限制性核酸内切酶BamHI和SpeⅠ/BamHI对重组质粒进行单酶切和双酶切，结果经琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小为14.9 kb的单条带和大小分别为4.5 kb与10.4 kb的双条带(图 2)，其中第一泳道中的单条带大小与重组质粒pCH-lac的大小相符合，而第二泳道中双条带的大小分别与表达盒中Pcbh1+lac+Tcbh1和pCB-h的序列大小相符。
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图 2 重组质粒pCH-lac的酶切验证 Fig.2 Enzyme digestion of recombinant plasmid pCH-lac M: DNA Marker; 1: plasmid pCH-lac digested by BamHI; 2: plasmid pCH-lac digested by SpeⅠ and BamHI |
图 3为里氏木霉转化子摇瓶培养96 h的产酶结果，其中转化子ZJ09产的漆酶酶活最高(8.8 IU·mL-1)，而出发菌株无漆酶活力。
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图 3 原始里氏木霉和转化子产漆酶实验结果 Fig.3 Results of laccase prodution by origin T.reesei and transformants. 0: origin T.reesei; 1~9: transformants ZJ01~09 Each value is the average of three replicates, error bars indicate standard error |
图 4显示了重组转化子ZJ09在分批发酵及补料分批发酵条件下的产酶进程，从图中可以看出：分批发酵条件下，由于菌丝体的快速生长，培养初期pH迅速降低，还原糖浓度(w/v)快速下降，而漆酶活力缓慢上升。24 h后pH值开始回升，48 h后基本保持稳定；发酵液中的漆酶活力在24~72 h期间快速上升，至96 h达到8.8 IU·mL-1)。此后由于培养液中作为碳源和诱导物的乳糖浓度已趋近于零，菌丝开始老化，酶活力出现下降。
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图 4 重组里氏木霉ZJ 09产酶进程 Fig.4 Profiles of laccase production by recombinant T.reesei ZJ09 (a) batch fermentation (b) fed-batch fermentation; ■ laccase activity by fed-batch fermentation ○ reducing sugar concentration ▲ pH Each value is the average of three replicates, error bars indicate standard error |
从图 4(b)中可以看出：在分批补料发酵培养条件下，由于在发酵48、72、96、120 h分别添加了乳糖，使得发酵液中的乳糖能够维持在一定的低浓度范围内，有利于避免菌丝的过度生长，同时也推迟了菌丝的过早衰老、死亡。与分批发酵工艺相比，分批补料发酵条件下漆酶活力可以得到明显提高，发酵7d(168 h)，发酵液中酶活可达20.3 IU·mL-1。若进一步优化补料工艺，酶活力还可以继续提高。
María Eugenia Eugenio等利用Pycnoporus sanguineus产漆酶，得到的酶活力为0.82 IU·mL-1[15]，卢春霞等将来自Pycnoporus sanguineus的漆酶基因导入毕赤酵母，其产漆酶水平为3.0 IU·mL-1[16]。本研究项目成功地实现了耐热真菌Pycnoporus sanguineus漆酶基因在里氏木霉中的高效表达和胞外分泌，为漆酶的规模化生产和应用奠定了坚实的基础。
3.3 漆酶对含有活性艳蓝KN-R印染废水的脱色试验 3.3.1 最适反应温度和pH值以活性艳蓝KN-R浓度64.5 mg·L-1的印染废水为试验材料，在酶用量为1.0 IU·mL-1、60℃反应5 h条件下，检测不同pH值(3.2~4.2)下的脱色率。如图 5(a)所示，脱色率随着pH值的变化先升高后下降。以最大脱色率为评价指标，得出最适反应pH值为3.6。
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图 5 pH值和温度对含活性艳蓝KN-R印染废水脱色的影响 Fig.5 Effects of pH and temperature on the decolorization of dye wastewater containing Reactive Brilliant Blue KN-R Each point is the average of three replicates, error bars indicate standard error. |
在酶用量为1.0 IU·mL-1、pH3.6条件下反应5 h，检测不同反应温度下印染废水的脱色率，发现反应温度为60℃时脱色率最高(图 5(b))。温度主要影响漆酶酶活，在较低温环境下，漆酶未达到最大酶活，因此随着温度升高漆酶酶活增加从而导致脱色率相应的提高；随后温度继续增加而脱色率却明显下降是因为较高温导致漆酶部分失活。上述酶学性质与Pycnoporus sanguineus漆酶的嗜酸和耐热特性相符[17]。
3.3.2 漆酶用量在60℃、pH3.6的条件下，研究不同漆酶用量(0.1~1.0 IU·mL-1)对印染废水脱色反应的影响。反应5 h测定脱色率结果见图 6。试验结果表明：在一定范围内，印染废水的脱色率随着漆酶用量的增加而升高，当酶用量达到0.7 IU·mL-1之后，继续加大漆酶用量不能进一步提升脱色率。因为在一个体系条件下反应的底物一定，当漆酶量较少时，底物与加入体系中的所有漆酶结合，因此在一定范围内，脱色率随着漆酶量增加而提高，但超过一定量后，体系中所有底物都已与漆酶结合，漆酶继续增加并不能提高脱色率。
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图 6 漆酶用量对含活性艳蓝KN-R印染废水脱色的影响 Fig.6 Effects of laccase dosage on the decolorization of dye wastewater containing Reactive Brilliant Blue KN-R. Each point is the average of three replicates, error bars indicate standard error |
在漆酶用量为0.7 IU·mL-1、pH 3.6、60℃条件下对印染废水进行脱色反应，反应5 h后脱色率达到91%(图 7)，显示出重组漆酶对印染废水具有明显的脱色作用。通常情况下，漆酶的催化反应体系中需要加入一些介体如ABTS、HBT等才能顺利进行[18]，此类介体不但价格昂贵，而且会对环境会造成二次污染[19]。本研究采用重组里氏木霉产漆酶，在无介体加入情况下即可对印染废水进行高效的脱色治理，显示了良好的应用前景。
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图 7 含活性艳蓝KN-R印染废水脱色的时间进程图 Fig.7 Decolorization profile of dye wastewater containing Reactive Brilliant Blue KN-R by the recombinant laccase Each point is the average of three replicates, error bars indicate standard error |
将来自耐热真菌Pycnoporus sanguineus的漆酶基因经过密码子优化后，插入到里氏木霉强启动子Pcbh 1和终止子之间，构建成重组质粒pCH-lac。利用根瘤农杆菌介导法将重组质粒转入里氏木霉，筛选获得了优良转化子。在分批补料发酵条件下，培养至第7天发酵液中的漆酶活力可达20.3 IU·mL-1。利用重组里氏木霉生产的漆酶对含活性艳蓝KN-R的印染废水进行脱色处理，脱色率可达91.0%。
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