2. 大连大学 医学院，辽宁 大连 116622
2. College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China
腺苷(Adenosine，ADE)化学名9- β - D -呋喃核糖基腺嘌呤,它是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可以用于冠状血管障碍、狭心症、动脉硬化症及高血压症等疾病的治疗，也是合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。同时它还是心肌缺血损害和心肌保护效果的重要指标，参与心肌能量代谢与扩张冠脉血管。腺苷对肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。目前，测定ADE的主要方法有高效液相色谱法[1, 2]、酶法[3]、电化学法[4~6]、化学发光检测法[7]。这些方法中有的存在仪器昂贵，操作复杂缺点，有的存在灵敏度和选择性较差的缺点。
本文参考相关研究报道[8, 9]，对 β -CD/ZnO-MWNTs化学修饰电极的制备以及对腺苷的电化学行为进行了研究，并采用循环伏安法和差分脉冲伏安法对冬虫夏草和玛卡等实际样品进行测定。该方法操作简便、测定快速、具有很高的灵敏度，可用于复杂样品的分析。
2 实验部分 2.1 仪器和试剂CHI600C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极系统：玻碳电极(GCE)或修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl(上海纳锘实业有限公司)，对电极为铂电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司)；KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；离心沉淀机80-1型(上海机械手术厂)；pHB-1型酸度计(上海宇隆仪器有限公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent科技有限公司)；FA1604型分析天平(上海雷韵试验仪器制造有限公司)。
β -环糊精( β -CD，Aladdin，天津市科密欧化学试剂开发中心)；多壁碳纳米管(MWNTs，纯度 > 95％， Ф = 8~15 nm，中国科学院成都有机化学研究所)；α-A12O3抛光粉(天津艾达恒晟科技发展有限公司)；铁氰化钾(北京化工厂)；腺苷，肌苷和腺苷-5’-磷酸，甲醇，乙腈和石油醚(国药集团化学试剂有限公司)。西藏玛卡由大连大学弓晓杰教授提供并鉴定。所有试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
2.2 修饰电极的制备 2.2.1 玻碳电极预处理将玻碳电极在金相砂纸(3000#)上打磨，然后在麂皮垫上依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末抛光，最后分别用二次蒸馏水，HNO3(50%(v))，无水乙醇和二次蒸馏水超声波清洗各3 min。将处理后的玻碳电极，置于0.5 mol⋅L-1的H2SO4溶液中，以50 mV⋅s-1扫描速度，在-0.5~+1.4 V电位区间循环扫描直至无峰[10]。将电极取出后用二次蒸馏水冲洗干净，此玻碳电极经处理后，其表面已达到清洁和活化的要求。最后将清洗完毕的电极保存在去离子水中备用。
2.2.2 纳米ZnO-MWNTs分散液的制备超声条件下将37 mg Zn(CH3COO)2×2H2O和100 mg聚乙二醇加入15 mL二次蒸馏水，50℃下，将8 mL 0.04 mmol⋅L-1 Li(OH)2H2O水溶液缓慢滴加到上述混合液中，滴加完成后恒温超声10 min，离心分离得到沉淀，用二次蒸馏水超声离心洗涤数次，70℃真空干燥后，置于瓷坩埚中放入箱式电阻炉，经过300℃热处理加工2 h，取出冷却至室温即可得到纳米ZnO。
采用V(HNO3):V(HCl) =1:3回流12 h的方法将MWNTs羧基化，用0.01 mol⋅L-1 NaOH洗至pH为近中性时止，离心后干燥。分别称取上述1 mg 纳米ZnO和2 mg预处理过的MWNTs于10 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中超声分散30 min，最后得到稳定的分散液。
2.2.3 β -CD/纳米ZnO-MWNTs修饰电极的制备图 1所示，以GCE为基体电极，在5⋅10-3 mol⋅L-1 β -CD+0.5 mol⋅L-1 H2SO4介质中，且溶液静止条件下，通过电聚合的方式，于-0.6~+1.0 V电位范围之间以100 mV⋅s-1的扫速循环扫描20周至循环伏安图(CV)曲线稳定，然后取出电极，经去离子水淋洗电极表面，干燥，得到 β -CD/GCE[11]。然后用微量移液器取适量的纳米ZnO-MWNTs分散液，滴涂在 β -CD/GCE上，部分纳米粒子会进入 β -CD的空腔内，提高选择性，最后红外灯下烘干即制得 β -CD/ZnO-MWNTs/GCE。
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图 1 β-CD/纳米ZnO-MWNTs 修饰电极的制备 Fig.1 Preparation of the β-CD / nanometer ZnO-MWNTs modified electrode |
色谱柱：Diamonsil C18，(250 mm⋅4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)和水(B)；梯度洗脱程序：0~40 min，60%A~100%A；流量：1 mL⋅min-1；柱温：40℃；二极管阵列紫外检测器，波长260 nm。
2.3 实验方法测定前先将电极置于缓冲溶液中，以 -1.2~+1.0 V循环扫描数次至有良好的重复性,然后将电极插入样品溶液中静置富集一定时间后，采用示差脉冲和循环伏安法研究腺苷在该电极上的电化学行为。电位扫描范围为 -1.2~+1.0 V，扫描速度为100 mV⋅s-1，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms。计时库仑法的电位阶跃范围为 -1.2~+0.6 V，静置富集18 min，脉冲宽度为20 s。
3 结果与讨论 3.1 修饰膜的聚合与表征图 2为玻碳电极在 β -CD中电聚合过程的循环伏安曲线。可以看出， β -CD的电聚合过程是不可逆过程，随着扫描圈数的增加，峰电流不断降低，表明玻碳电极表面逐渐形成聚合膜。在电位范围为 -0.2~ +0.7V，100 mV⋅s-1扫描速率下，分别用GCE、 β -CD/GCE、 β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE在K3Fe(CN)6溶液中用循环伏安法扫描。如图 3所示， β -CD/GCE (曲线a)比GCE(曲线b)峰电流低，这是由于 β -CD聚合膜的弱导电性所造成的。 β -CD/ZnO- MWNTs/GCE(曲线c)峰电流值明显最大，表明 β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE电极能有效传递电子。
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图 2 β-CD 的电聚合CV 图 Fig.2 Cyclic voltammograms of β-cyclodextrin polymerization on bare GCE (5×103 mol⋅L-1 β-CD 0.5 mol⋅L-1 H2SO4); scan rate: 100 mV⋅s-1 |
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图 3 不同电极在铁氰化钾中的CV 曲线 Fig.3 Cyclic voltammograms of β-CD/GCE (a), bare GCE (b), β-CD/ ZnO-MWNTs/GCE (c) in the 5×10-3 mol⋅L-1 potassium ferricyanide; scan rate: 100 mV⋅s-1; supporting electrolyte: 0.2 mol⋅L-1 PBS pH 7.0 |
将GCE、 β -CD/GCE和 β -CD/ ZnO- MWNTs/GCE在5.0×10-3 mol⋅L-1 K3[Fe(CN)6]中，以计时库仑法进行研究。根据Anson[12]公式：
| $Q = 2nFCA{\pi ^{ - 1/2}}{D^{1/2}}{t^{1/2}} + {Q_{ads}} + {Q_{d1}}$ | (1) |
式中， A 为工作电极的有效表面积， C 是电解质的浓度， n 为电子传递数， D 是电解质的扩散系数，已知K3[Fe(CN)6]的 n 和 D 分别为1和7.6×10-6 cm2⋅s-1[13]。由公式(1)，分别作三个电极的 Q - t 1/2关系曲线(GCE： Q = 36.54 t 1/2-3.481； β -CD/GCE： Q = 34.36 t 1/2-32.73； β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE： Q = 2111.9 t 1/2-2216.9)，由 Q - t 1/2线性关系的斜率，即可计算得到GCE、 β -CD/GCE和 β -CD/ZnO-MWNTs/GCE的有效表面积分别为0.0244、0.0229和1.407 cm2。因此，纳米氧化锌与碳纳米管增大了玻碳电极的微观表面积。
图 4为GCE、 β -CD/GCE和 β -CD/ZnO-MWNTs/GCE三种电极在测定相同浓度ADE标准溶液的极化曲线， β -CD/GCE (a)较GCE的峰电流高，表明 β -CD对ADE有良好的电化学响应，而 β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE(c)峰电流较b提高了100倍以上，表明纳米氧化锌与碳纳米管起到了增敏作用。
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图 4 不同电极测定相同浓度腺苷标准品的极化曲线 Fig.4 Polarization curves of β-CD/GCE (a) , bare GCE (b) and β-CD/ ZnO-MWNTs/GCE (c) in the measurement of ADE with same concentration |
扫速在30~150 mV⋅s-1，采用循环伏安法研究0.1 g⋅L-1ADE在修饰电极表面的电化学机理，其结果如图 5所示。其中a峰峰电位不随扫描速度改变，表明a峰的反应为可逆反应，d峰的峰电流 I p随扫速的增大而增大，符合方程： I p = 0.94 v + 17.42 (R2 = 0.9982)，说明该反应主要是吸附控制的电极过程[14]。d峰电位 E p随扫速的增大正移，并且与扫速的对数呈良好的线性关系： E p= 0.0222ln v + 0.62 (R2 = 0.9883)。根据Laviron[15]公式：
| $\begin{array}{l} {E_p} = {E^0} + \left[ {RT/\left( {anF} \right)} \right]\ln \\ \left[ {RT{k_s}/\left( {anF} \right)} \right] + \left[ {RT/\left( {anF} \right)} \right]\ln v \end{array}$ | (2) |
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图 5 ADE 在修饰电极上的CV 曲线 Fig.5 CV curves of ADE on the modified electrode |
式中，斜率为 RT/αnF ， T 为绝对温度， v 为扫描速度，V⋅s-1， k s为反应动力学常数，实验室温298 K，计算得 αn 约为1.15，由此可知电荷传递系数 α 约为0.55，电子数 n 为2，即ADE的氧化反应为双电子过程。
缓冲溶液的pH对ADE的电化学响应有重要的影响，因此，考查了ADE在不同pH的PBS缓冲溶液中的伏安行为，其中pH = 6.0时峰形最好。对于d峰，满足方程： E p = -0.0501 pH +0.7324 (R2 = 0.9895)。斜率–0.0501 V⋅pH-1较接近理论值 –0.059 V⋅pH-1，表明电子转移数与质子转移数之比为1:1，且为两电子两质子的氧化过程。
3.4 选择性实验用pH = 6.0的PBS缓冲溶液配制的0.1 g⋅L-1ADE、0.01 g⋅L-1肌苷(INO)、0.01 g⋅L-1腺苷-5’-磷酸((5'-AMP)和它们的混合溶液(ADE+INO+5'-AMP)，预富集后，用循环伏安法进行扫描。如图 6所示。对于d峰， β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE几乎对肌苷没有响应(曲线1)，对腺苷-5’磷酸的电化学响应(曲线2)较腺苷(曲线3)低,测定混合溶液时(曲线4)，峰电流的偏差仅为5.46%，表明该电极对ADE具有良好的选择性。
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图 6 β-CD/ ZnO-MWNTs/GCE 的选择性 Fig.6 Selectivity of β-CD/ ZnO-MWNTs/GCE for INO(1), 5'-AMP (2), ADE(3), ADE+INO+5'-AMP (4) |
在最佳实验条件下，用循环伏安法(CV)和示差脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的ADE标准溶液进行测定，其中b峰呈现良好的线性关系，如图 7和图 8所示。其线性范围、线性回归方程和检出限结果如表 1所示。对0.1 g⋅L-1ADE标准溶液进行10次平行实验，RSD分别为3.2%，表明此电极测定具有良好的重现性。 β -CD/ZnO-MWNTs/GCE在室温下放置20 d，相同条件下再次测定时，峰电位和峰电流仍较为稳定，表明该修饰电极具有良好的稳定性。
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图 7 不同浓度ADE 的DPV 曲线 Fig.7 DPV curves of ADE with concentrations of 1~6: 0.01, 0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.4 g⋅L-1 |
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图 8 不同浓度ADE 的CV 曲线 Fig.8 CV curves of ADE with concentrations of1~7: 0.004, 0.01,0.02,0.04,0.1,0.2,0.4 g⋅L-1 |
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表 1 测定⋅ADE⋅的线性范围、回归方程、相关系数和检出限 Table 1 Linear ranges,equations,correlation coefficients and detection limits for ADE measurements⋅ |
将冬虫夏草粉碎，取样品粗粉2 g，置圆底烧瓶中，加90% 甲醇40 mL；回流提取30 min，过滤[16]，用PBS缓冲溶液稀释至100 mL。精密称取玛卡根l.0 g，研磨粉碎，用甲醇与水的混合液超声提取，过滤，用PBS缓冲溶液稀释至100 mL，然后对上述样品分别用循环伏安法和高效液相色谱法(HPLC)进行回收率实验，结果见表 2。对比实验表明， β -CD/ ZnO-MWNTs/GCE的加标回收率为98%~110%(与高效液相色谱方法的测定结果相当)，相对标准偏差为1. 9%~3.5%，表明修饰电极具有潜在的应用价值。
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表 2 样品中回收率测定结果 Table 2 Recovery of ADE from different samples |
用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究了腺苷在自制 β -CD/ZnO-MWNTs修饰电极上的电化学行为及样品含量分析。结果表明，ADE的氧化反应为两电子两质子过程，在4×10-3~4×10-1g⋅L-1该修饰电极的电化学响应峰电流与腺苷浓度呈现良好的线性关系，检测限可达5×10-4 g⋅L-1。冬虫夏草和玛卡提取液中腺苷含量测定的加标回收率在98%~110%。
符号说明：
| A | 工作电极的有效表面积，cm2 | Q ads | 表面吸附产生电量，C |
| C | 电解质浓度，moL⋅L-1 | Q dl | 双电层电量，C |
| D | 电解质传递系数 | R | 理想气体常数 |
| E p | 峰电位，V | T | 绝对温度，K |
| E 0 | 式量电位，V | α | 电荷传递系数 |
| I p | 峰电流，A | t | 电解时间，min |
| n | 电子传递数 | v | 扫描速度，V⋅s-1 |
| Q | — 电极通过的电量，C |
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