细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)是由CD3⁺CD56⁺细胞、CD3⁺CD56^-细胞和一小部分CD3^-CD56⁺细胞组成的异质型细胞群^[1-2]。其中CD3⁺CD56⁺细胞是CIK细胞的主要效应细胞，以无非主要组织相容性复合体限制(major histocompatibility complex, MHC)的方式发挥其杀伤肿瘤细胞的活性^[3-4]。临床研究表明以CIK细胞为基础的细胞治疗在很大程度上改善了患者的生存质量、总体生存时间和总生存数，使其成为备受关注的研究领域之一^[5-6]。但是外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中CD3⁺CD56⁺细胞的含量只有1%~5%，不能满足临床需求^[7]。因此需要通过经济有效的方式经体外诱导扩增获得足够数量的CIK细胞。

多糖作为一种生物大分子物质具有抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等活性。有研究表明多糖是造血微环境中的重要组成成分，能调节细胞的增殖、分化、凋亡和代谢等生命活动^[8-9]。黄原胶是由两分子葡萄糖、两分子甘露糖和一分子葡萄糖醛酸组成的胞外大分子杂多糖，分子量在2×10⁵到2×10⁶ Da，结构式如图 1所示^[10-11]。由于黄原胶物理化学性质稳定，常被用作药品辅助剂、增稠剂、稳定剂等，在食品和医药行业具有广泛应用^[12]。CHEN等^[13]研究发现黄原胶可通过降低胞内活性氧和线粒体通透性使过氧化氢处理过的细胞免受凋亡。SCHUCH等^[14]报道黄原胶可以用作疫苗佐剂，在BALB/c小鼠中显示出免疫调节的潜能。LIU等^[15]在IMDM+10%胎牛血清体系中，考察黄原胶对巨噬细胞增殖的影响，发现添加100μg·mL^-1黄原胶可显著促进巨噬细胞的增殖。ZHANG等^[16]报道黄原胶既能促进αβ T细胞的增殖，又能增强其对肿瘤细胞的杀伤活性。这些研究表明黄原胶具有调控细胞的增殖和凋亡的作用。

图 1(Fig. 1)

图 1 黄原胶的结构式[10-11] Fig.1 Molecular structure of xanthan gum[10-11]

在CIK细胞体外制备过程中多采用(1~2)×10⁶ cells·mL^-1的接种密度，高接种密度由于细胞生长空间以及营养供给等方面的不足，不利于CIK细胞的扩增。但是CIK细胞的高密度扩增，可以减少培养体系的体积以及培养基的用量，降低细胞制备的成本，减轻患者的负担^[17]。因此，本文以CIK细胞高密度扩增为目标，通过在培养体系中添加具有免疫调节功效的黄原胶，根据总细胞扩增倍数、效应细胞比例和扩增倍数以及CIK细胞的杀伤活性探讨黄原胶对CIK细胞高密度扩增的影响，实现了CIK细胞的高效扩增，为CIK细胞体外扩增过程的优化提供技术支持。

RPMI 1640购于美国Gibco公司；无血清培养基(自配)；PBMC购于上海Allcells公司；CD3单克隆抗体购于美国eBioscience公司；植物血凝素PHA购于美国Sigma-Aldrich公司；干扰素(IFN-γ)、白介素-2 (IL-2)和白介素1α (IL-1α)均购于美国Pepro Tech公司；FITC标记的鼠抗人CD3抗体和PE标记的鼠抗人CD56抗体购于美国Becton Dickinson (BD)公司；胎牛血清购于BioSun公司；黄原胶购于山东斯比凯可生物有限公司，其平均分子量约2.95×10⁶ Da。

将PBMC以1×10⁶ cells·mL^-1或者4×10⁶ cells·mL^-1的密度接种于装有5 mL无血清培养基的T25方瓶中，并添加1 000 U·mL^-1 IFN-γ，24 h后添加100 U·mL^-1 IL-1α、500 U·mL^-1 IL-2、0.5 μg·mL^-1 PHA和50 ng·mL^-1 CD3，于37 ℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养21 d。在培养过程中每天取样计数，补加新鲜培养基和500 U·mL^-1 IL-2维持细胞密度在接种时的密度。

采用血球计数板进行计数，将细胞稀释到适宜浓度，随后取20 μL细胞液加入到计数板上，在显微镜下记录8个大格中的细胞数，并计算细胞密度。

PBMC计数时需要先用3%冰醋酸裂解部分红细胞，再用低渗结晶紫染色，计算得到着色细胞密度，即视为PBMC细胞密度。

采用台盼蓝计数计算细胞的活性，将细胞悬液与台盼蓝溶液按1:1的体积混合，用血球计数板计数，其中透亮的为活细胞，染上蓝色的为死细胞，根据总细胞数和活细胞数计算总细胞的活性。

采用流式细胞术对细胞进行表型分析，本文分析起始和培养21 d后培养物中CD3⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞的比例。收集5×10⁵~1×10⁶个细胞，用10 μL FITC-CD3和10 μL PE-CD56的流式抗体标记收集的细胞，在4 ℃孵育30 min后用FASC Callibur(美国BD公司)进行细胞表型分析，结果运用FlowJo软件进行处理。

以CIK细胞为效应细胞(E)，K562细胞为靶细胞(T)，采用CCK8检测细胞活性，以此评价CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。将1×10⁵个CIK细胞与1×10⁴个K562(E:T=10:1)细胞同时加入0.1 mL RPMI 1 640+10%胎牛血清的培养基中，将1×10⁵个CIK细胞和1×10⁴个K562细胞分别加入上述培养基中作为对照组。在培养箱中孵育24 h后加入10μL CCK-8，继续在培养箱中孵育4 h，检测450 nm处的OD值，其中1×10⁵个CIK细胞、1×10⁴个K562细胞、以及1×10⁵个CIK细胞与1×10⁴个K562细胞共培养检测得到的OD值分别是OD_E、OD_T、OD_E/T。根据下式计算杀伤活性。

本文用T检验(T-test)进行两组之间的统计分析，结果以平均值±标准偏差(SD)表示，p < 0.05代表有显著差异。

本文首先考察了细胞接种密度对CIK细胞体外扩增的影响。PBMC分别以1×10⁶ cells·mL^-1和4×10⁶ cells·mL^-1接种到无血清培养基中，每天补液维持细胞密度于起始密度。培养至21 d，分析总细胞扩增倍数、培养物中CD3⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞比例及扩增倍数、CIK细胞杀伤活性的差异，评估CIK细胞在2种培养条件下的扩增特性。

培养过程中细胞活性和总细胞扩增倍数变化如图 2所示。当细胞密度维持在4×10⁶ cells·mL^-1时，培养过程中细胞活性大部分时间内均显著低于1×10⁶ cells·mL^-1时的数据(p < 0.05)(图 2A)，相对应的其总细胞扩增倍数也显著低于1×10⁶ cells·mL^-1时的数值；培养到21 d时，总细胞扩增倍数达到41.1±5.1，显著低于1×10⁶ cells·mL^-1密度培养时的291.3±77.1(图 2B)(p < 0.05)。可见，维持高密度培养不利于总细胞的扩增。

图 2(Fig. 2)

图 2 细胞接种密度对细胞活性和总细胞扩增倍数的影响 Fig.2 Effects of cell inoculation density on cell viability and expansion of total cells A: cell viability; B: the expansion fold of total cells; n=3 *: compared with 1×106 cells·mL-1, P < 0.05

分析培养过程中培养物的细胞表型，结果如图 3所示。起始PBMC中CD3⁺细胞比例为(63.8±10.8)%，培养到21 d时，2种接种密度下CD3⁺细胞比例均达到90%以上，显著高于起始时CD3⁺细胞比例(p < 0.05)(图 3A)；而初始PBMC中CD3⁺CD56⁺细胞比例为(7.6±3.5)%，培养21 d后2个密度下扩增的培养物中CD3⁺CD56⁺细胞比例均值均有提高，但4×10⁶ cells·mL^-1密度下培养物中CD3⁺CD56⁺细胞比例可达到(13.2±6.8)%，显著低于1×10⁶ cells·mL^-1密度培养时的(20.3±7.9)%(p < 0.05)(图 3B)。2种细胞的扩增倍数见图 3C和3D，结果表明无论是CD3⁺细胞还是CD3⁺CD56⁺细胞，当细胞密度维持在4×10⁶ cells·mL^-1时，其扩增倍数均明显低于1×10⁶ cells·mL^-1密度时的数值(p < 0.05)。说明，高密度培养时难以获得效应细胞的高效扩增。

图 3(Fig. 3)

图 3 细胞接种密度对效应细胞比例和扩增的影响(n=3) Fig.3 Effects of cell inoculation density on proportion and expansion of effector cells (n=3) A: CD3+ cells proportion; B: CD3+CD56+ cells proportion; C: CD3+ cells expansion fold; D: CD3+CD56+ cells expansion fold *: compared with 1×106 cells·mL-1, P < 0.05

进一步以K562细胞为靶细胞，检测扩增21 d后CIK细胞的杀伤活性，结果如图 4所示。当效靶比为10:1时，以1×10⁶ cells·mL^-1密度培养所获得的CIK细胞的杀伤活性为(42.3±3.1)%，显著高于以4×10⁶ cells·mL^-1密度培养时的(28.7±4.0)%(p < 0.05)。可见高密度培养所获得的CIK细胞，杀伤活性减弱。

图 4(Fig. 4)

图 4 细胞接种密度对扩增后CIK细胞杀伤活性的影响(n=3) Fig.4 Effects of cell inoculation density on cytotoxicity of expanded CIK cells (n=3) *: compared with 1×106 cells·mL-1, P < 0.05

由于在无血清培养基中无法实现细胞的高密度培养，且扩增后CIK细胞的活性有所减弱。为此，考虑采用在培养基中添加黄原胶的手段提高CIK细胞在高密度条件下的扩增效率。将PBMC以4×10⁶ cells·mL^-1的密度接种于含有100 μg·mL^-1黄原胶的无血清培养基中，每天补液维持细胞密度于起始密度。培养至21 d，以总细胞扩增倍数、培养物中CD3⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞比例及扩增倍数、CIK细胞杀伤活性为评价指标，评估黄原胶对CIK细胞高密度培养的影响。

图 5为总细胞的扩增效果。由图 5A可以看出，添加黄原胶并不影响细胞活性，但可显著提高总细胞的扩增倍数，培养到21 d时总细胞的扩增倍数达到150.0±29.1，显著高于不含黄原胶的对照组的41.1±5.1(p < 0.05)(图 5B)。

图 5(Fig. 5)

图 5 黄原胶对细胞活性和总细胞扩增倍数的影响 Fig.5 Effects of xanthan gum on cell viability and expansion of total cells A: cell viability; B: the expansion fold of total cells; n=3 *: compared with control, P < 0.05

培养物中CD3⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞比例及扩增倍数结果如图 6所示。培养21 d后黄原胶组与对照组培养物中CD3⁺细胞比例相近，均达到90%以上；而其中主要效应细胞CD3⁺CD56⁺细胞比例，黄原胶组的数值显著高于对照组(p < 0.05)(图 6A)。黄原胶组的CD3⁺细胞和CD3⁺CD56⁺细胞扩增倍数可分别达到230.6±70.9和321.4±48.6，显著高于对照组的60.7±10.1和71.4±31.3(p < 0.05)(图 6B)。可见，添加黄原胶后显著提高了高密度培养条件下效应细胞的扩增效果。

图 6(Fig. 6)

图 6 黄原胶对效应细胞比例和扩增的影响 Fig.6 Effects of xanthan gum on proportion and expansion of effector cells A: Effector cells proportion; B: Effector cells expansion fold; n=3 *: compared with control, P < 0.05

图 7中CIK细胞杀伤活性的检测结果显示，添加黄原胶扩增获得的CIK细胞的杀伤活性高于对照组。

图 7(Fig. 7)

图 7 黄原胶对扩增后CIK细胞杀伤活性的影响 Fig.7 Effects of xanthan gum on cytotoxicity of expanded CIK cells (n=3) *: compared with control, P < 0.05

本文通过在培养基中添加一定浓度的具有免疫调节活性的黄原胶，提高了高密度条件下CIK细胞的扩增效果，以及扩增后CIK细胞的杀伤活性，为用于细胞治疗的效应细胞的高效制备提供了一个新的思路。