雄甾-4-烯-3, 17-二酮 (AD) 是用于合成多种甾体激素类药物如免疫抑制剂、利尿剂、性激素以及神经甾体等^{[1, 2]}的重要中间体，它们主要以薯蓣皂苷为原料通过一系列的化学反应制备得到。植物甾醇 (phytosterols) 是木材、大豆、甘蔗、甜菜等加工过程中产生的废料，储量丰富、价格低廉，通常是豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇等组成的混合物^[3]。研究发现，分枝杆菌 (Mycobacterium sp.) 能够选择性降解植物甾醇侧链得到AD^[4]，从而可有效解决化学法生产AD带来的环境污染和薯蓣皂苷原料短缺等问题，因此受到人们的广泛关注。但是，分枝杆菌降解植物甾醇过程中仍然存在两方面问题：(1) 在水溶液中甾醇的溶解度通常低于1 μmol⋅L^-1，限制了微生物对底物的吸收利用^[5]；(2) 产物对细胞生长具有抑制甚至毒害作用^[6]，影响产物生成。因此，目前的研究重点是如何在提高底物溶解度的同时，能够解除产物抑制。

萃取发酵 (extractive fermentation) 是集发酵和产物的原位回收 (In Situ Product Recovery，ISPR) 为一体的过程^[7]。传统的发酵过程中，细胞、底物和产物共存，发酵体系成分混杂，产物的分离纯化过程冗长。在传统的发酵过程中添加有机溶剂^[8]或植物油^[9]、离子液体^[1]、水溶性高聚物^[10]等萃取剂形成两相，使得底物、产物和催化剂分开，从而解除了底物抑制和产物毒害作用。因此，萃取发酵是解决发酵过程中的产物抑制作用、提高产率的有效手段。其中，双水相体系 (Aqueous Two Phase System，ATPS) 是一种生物相容性好，环境友好型反应体系，在萃取发酵方面具有很好的应用前景^[11]。双水相体系的两相水含量高达65-90%，条件温和，短时间内能够实现高效、连续化生产，在生物催化和转化过程中的应用逐渐受到重视^[12]。双水相体系用于甾醇的降解已有报道，Flygare和Larsson^[10]研究了成相聚合物种类对细胞分配的影响并初步应用于胆固醇的降解，郝雪秦等^[13]和杨英等^[14]考察了聚合物浓度对ADD/AD生产的影响，转化时间为120-240 h，显示了双水相体系应用于甾醇降解的可行性和优势。

分枝杆菌降解植物甾醇生产AD是一个典型的产物抑制过程。产物以结晶的形式存在于溶液中或包结于细胞表面，抑制细胞生长的同时阻碍细胞对底物的进一步利用。双水相体系能够实现产物的萃取发酵，同时又不影响质量传递速率，较好地满足了分枝杆菌降解植物甾醇生产AD的要求。本文拟研究几种常见的双水相体系即聚乙二醇/葡聚糖、聚乙二醇/盐在萃取发酵生产AD中的应用，以期在高底物投料条件下获得较高的AD产率。

雄甾-4-烯-3, 17-二酮 (AD)，纯度≥98%，由浙江台州仙琚制药有限公司提供。植物甾醇 (phytosterols)，纯度≥95%，白色粉末，主要成分为β-谷甾醇 (45%)、豆甾醇 (26.2%)、菜油甾醇 (26.2%) 和菜籽甾醇 (3.2%)，购自西安海斯夫生物科技有限公司。各种分子量的聚乙二醇 (Polyethylene Glycol, PEG) 和葡聚糖购自阿拉丁试剂公司，其他均为市售生化试剂。

分枝杆菌 (Mycobacterium sp. MB 3683)，购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

种子培养基：葡萄糖5 g⋅L^-1，胰蛋白胨5 g⋅L^-1，牛肉浸膏3 g⋅L^-1，NaCl 15 g⋅L^-1，甘油1.5% (V/V)，pH 7.0。

发酵培养基：葡萄糖5 g⋅L^-1，植物甾醇1 g⋅L^-1，柠檬酸2 g⋅L^-1，柠檬酸铁铵0.05 g⋅L^-1，K₂HPO₄ 0.5 g⋅L^-1，(NH₄)₂HPO₄ 6 g⋅L^-1，MgSO₄ 0.5 g⋅L^-1，Tween 80 0.3% (V/V)，pH 7.0。

配制50% (wt) 不同分子量的PEG、葡聚糖和无机盐母液，其中葡聚糖需要沸水溶解。所有聚合物以及无机盐的浓度均以质量浓度计算，使用时用蒸馏水或培养液将母液按比例稀释，得到不同组成的双水相体系。

按照ATPS组成，将相应的母液加入到15 mL离心管，用蒸馏水将体系补足到10 g，得到双水相体系。测定时加入相应质量的AD (0.1 g⋅L^-1) 或细胞 (湿重，10 g⋅L^-1)，剧烈震荡混匀，充分静置后，上相用吸管移出，下相在离心管底部戳洞流出以保证不破坏相界面。相比 (PR)、细胞及AD的分配系数 (K_Cell, K_AD) 分别由以下公式计算：

式中V_T, V_B是上、下相的体积，C_{T, Cell}，C_{B, Cell}是上、下相中细胞的浓度，C_{T, AD}，C_{B, AD}是上、下相中产物AD的浓度。

按照ATPS组成，将相应体积的浓缩发酵培养基加入带挡板的100 mL锥形瓶中。在灭菌过程中，为防止褐变，葡聚糖母液和培养基溶液分别灭菌 (115 °C，30 min)。灭菌后向发酵培养基中加入相应的成相组分 (高聚物/高聚物或者高聚物/盐) 制备10 g双水相体系。放大实验中，分别将50 g、100 g、200 g ATPS体系加入到带挡板的250 mL、500 mL、1000 mL锥形瓶中，底物投料为10 g⋅L^-1，在优化的条件下进行萃取发酵。

细胞浓度采用紫外/可见分光光度计 (Ultrospec 3300 Pro，美国GE Healthcare公司) 测定。待测菌液混匀后，吸取适量加入到比色皿中，用空白溶液做参比对照，记录分枝杆菌细胞在650 nm吸光度 (OD) 变化^[8]。

发酵结束后，加入相同体积的乙酸乙酯，剧烈震荡萃取20 min。静置数分钟后，取1 mL上相离心 (12, 000 r⋅min^-1, 1 min)。取200 μL离心后的上清液，60 °C烘干4 h，残余物用1 mL色谱甲醇溶解，有机滤膜过滤后用于高效液相色谱仪 (Aglient 1100，美国Agilent公司) 分析。Hypersil ODS-2色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)。检测器为VWD signals紫外检测仪，检测波长254 nm。流动相为甲醇:水=8:2 (V/V)，流速1 mL⋅min^-1，进样量20 μL，恒定洗脱10 min，其中保留时间4.67 min的洗脱峰为产物AD。

分配系数是评价萃取发酵效率的重要参数，一般用于生物催化过程的ATPS要满足细胞分布在下相 (或上相)，而产物分布在上相 (或下相) 的要求。PEG/盐体系在生物转化中具有一定的优势，如黏度低，成相剂成本不高。静置平衡后，上相为PEG聚集相，下相为盐富集相。本文首先测定了细胞和产物AD在不同种类无机盐与聚乙二醇6000(PEG 6000) 形成的双水相体系中的分配系数，结果如表 1所示。由表可见，细胞的分配系数均远小于AD的分配系数。实验中观察到细胞基本分布在界面附近，主要是由于细胞之间的相互聚集沉淀所致。而AD的分配系数远大于1，说明其几乎全部分布在PEG富集的上相。由表 1可见AD的浓度C_AD很小，即在发酵过程中几乎检测不到产物AD。这是因为，据报道PEG/盐体系要求较高的盐浓度才能形成两相，而高盐浓度会影响催化剂的活性，因而不适用于生物催化过程^[15]。

表 1(Tab. 1)

表 1 不同种类的无机盐/PEG 6000双水相体系中产物AD、细胞的分配以及AD产量 Table 1 AD yields and partition of AD/cells in different salt/PEG 6000 aqueous two-phase systems Salt a PR KAD KCell CAD/g⋅L-1 c NaCl -b - - 0.0002 (NH4)2SO4 0.6 413.5 1.5 0.001 MgSO4 0.5 196.9 5.1 0.003 (NH4)2HPO4 0.6 842.2 10.3 0.001 K2HPO4 0.7 274.2 2.0 0.001 a PEG 6000 (7% (wt)), salt (15% (wt)); b without two phase formed; c final AD concentration in fermentation broth (phytosterols 1 g⋅L-1, Tween 80 0.3% (V/V))

表 1 不同种类的无机盐/PEG 6000双水相体系中产物AD、细胞的分配以及AD产量 Table 1 AD yields and partition of AD/cells in different salt/PEG 6000 aqueous two-phase systems

在PEG/葡聚糖两相体系中，目标产物AD在ATPS中的分配与PEG相对分子量有关，如表 2所示。总体来说，AD的分配系数随着PEG分子量 (MW) 的增大而增加。通常，由于体积排阻作用，某一种成相聚合物的分子量增大将促使生物分子分配到另外一相。但也有例外情况，如苯丙氨酸脱氢酶的分配系数随着PEG分子量的增大而增大^[16]。在PEG/葡聚糖体系中，富含PEG的上相比富含葡聚糖的下相疏水性更强。AD结构中含有环戊烷多氢菲母核，具有显著的疏水性^[5]，因此随着PEG分子量的增大倾向于分配到疏水性更强的上相。生物分子与两相之间的相互作用包括范德华力、分子间静电作用以及体积排阻作用^[17]，因此，在分析产物的分配系数随PEG分子量的变化时，不仅要考虑到聚合物的体积排阻作用，还需综合考虑其他相互作用。

表 2(Tab. 2)

表 2 不同分子量的PEG/葡聚糖70000双水相体系中产物AD、细胞的分配以及AD产量 Table 2 AD yields and partition of AD/cells in PEG/dextran 70000 aqueous two-phase systems MWPEG a PR KAD KCell CAD/ g⋅L-1 c 200 -b - - 0.02 400 - - - 0.03 2000 - - - 0.07 4000 1.9 0.3 0.6 0.15 6000 1.7 1.9 0.7 0.16 8000 1.8 2.4 1.3 0.15 10000 1.8 4.2 2.1 0.15 20000 2.0 3.0 2.0 0.09 a PEG (7% (wt)) with different molecular weights, dextran 70000 (8% (wt)); b without two phase formed; c final AD concentration in fermentation broth (phytosterols 1 g⋅L-1, Tween 80 0.3% (V/V)).

表 2 不同分子量的PEG/葡聚糖70000双水相体系中产物AD、细胞的分配以及AD产量 Table 2 AD yields and partition of AD/cells in PEG/dextran 70000 aqueous two-phase systems

细胞在ATPS中的分配取决于细胞的表面性质。分枝杆菌细胞壁富含大量的蜡、脂质和分枝菌酸^[18]，具有很强的疏水性，因此细胞倾向于转移到疏水性较强的上相或聚集在两相的相界面处。随着PEG分子量的增加，上相的疏水性增强^[13]，分枝杆菌分配系数变大，即更倾向于分布在PEG富集的上相。本文中，分子量较低的PEG，如分子量200、400和2000的PEG均不能和分子量70000的葡聚糖形成两相。可见成相聚合物的分子量越低，能够形成两相的聚合物浓度要求越高，因此相对分子量较高的PEG更适用于萃取发酵。

微生物降解植物甾醇侧链生产AD的过程包括由11种酶催化的16步连续反应，反应过程需要辅因子的参与，因此要求细胞保持活性以满足辅因子再生的条件^[19]。在PEG/葡聚糖体系中，葡聚糖生物相容性好，对微生物细胞具有一定的稳定作用^[14]，但是PEG可能破坏细胞膜的完整性甚至导致细胞裂解^[20]。不同分子量的PEG对细胞生长的影响多有报道，如枯草芽孢杆菌生产枯草菌素的过程中，分子量6000的PEG没有明显的抑制作用，而低分子量的PEG (如分子量600、1540、4000) 则抑制细胞生长^[7]。本文也考察了不同分子量的PEG与分枝杆菌的生物相容性，如图 1所示。低分子量的PEG，如分子量200、400、2000，对分枝杆菌的生长具有一定的抑制作用。分析其原因，PEG常用作原生质体融合的促溶剂^[19]，因此PEG对细胞的毒害作用应类似于PEG在原生质体融合中发挥的作用。高分子量的PEG，如分子量4000、6000、8000，对细胞的生长无毒害作用。但随着PEG分子量的进一步增大，细胞的生长状况没有明显改善，可能是由于PEG分子量增大导致溶液黏度变高，限制质量传递速率，使得分枝杆菌生长受限。综合考虑PEG分子量对细胞生长的影响以及两相体系中AD的生成量 (表 2)，最终选择7% PEG 6000/8%葡聚糖70000形成的双水相，此时AD主要分布在富含PEG的上相，细胞则分布在富含葡聚糖的下相。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同分子量PEG对细胞的毒害性 Fig.1 Toxicity of different molecular weights PEG on Mycobacterium sp. MB 3683 cells (PEG 12% (wt), Tween 80 0.3% (V/V), monophasic aqueous system was used as a control)

由于分枝杆菌细胞呈疏水性，在水溶液中容易聚集^[18]，表面活性剂的加入有效阻止了分枝杆菌的聚集，且能够提高底物的分散性^[21]。本文考察了6种表面活性剂吐温40(Tween 40)、吐温80(Tween 80)、聚氧乙烯月桂醚 (Brij 35)、普流尼克F-68(Pluronic F-68)、乳化剂OP-4(OP-4)、曲拉通X-114(Triton X-114) 对AD生产的影响，结果如图 2。吐温80常用于疏水性甾醇的降解，据报道吐温80与胆固醇形成悬浮液能够显著提高ADD的产率^[22]。图 2表明双水相体系中添加吐温40比吐温80更有助于发酵产物AD的提高。这是因为，一方面，吐温80对分枝杆菌具有一定的毒害性，当吐温80添加量超过3 g⋅L^-1时分枝杆菌的生长受到明显的影响^[23]；另一方面，双水相的黏度远高于单相体系，剧烈震荡的条件下，双水相体系更易产生丰富的泡沫。吐温80吸附在泡沫表面，导致溶液的表面张力急剧下降，泡沫不易破碎^[23]，严重影响溶氧以及传质速率。而吐温40能够提高底物的溶解度，同时对分枝杆菌无毒害作用，因此能够显著提高产物AD的生成率。

图 2(Fig. 2)

图 2 不同表面活性剂对AD生产的影响 Fig.2 Influence of different surfactants on AD production (phytosterols 1 g⋅L-1, surfactants 0.3% (V/V), monophasic aqueous system with 0.3% (V/V) Tween 80 was used as a control)

表面活性剂将植物甾醇包裹其中形成悬浮液，使得细胞易于吸收利用^[24]。足够量的表面活性剂才能够起到较好的乳化作用，本文研究了吐温40添加量对发酵的影响，结果如图 3所示。在一定范围内，AD的浓度随着吐温40添加量的增多而增大；但吐温40添加量过高时，AD的生成量并没有进一步提高。有研究报道，吐温40生物相容性较好^[10]，不仅对细胞无毒害作用，并且能够作为碳源被分枝杆菌利用，但吐温40添加量超过1% (V/V) 时，胆固醇的转化时间推迟^[10]。如图 3，吐温40添加量过高时，分枝杆菌优先利用吐温40而不是降解植物甾醇侧链，因此AD的生产受到影响。

图 3(Fig. 3)

图 3 吐温40的添加量对AD生产的影响 Fig.3 Effects of Tween 40 addition on AD production (phytosterols 1 g⋅L-1)

在PEG/葡聚糖两相体系中，葡聚糖富集的下相黏度较高，使得溶氧量迅速降低^[7]，因此需要较高的转速来维持细胞生长及其对底物的利用。图 4考察了摇床转速对AD生产的影响，随着转速的增加，溶氧量增大^[25]，改善了体系中溶氧受限的情况，AD的生成量相应增大。同时，在剧烈搅拌的情况下，双相平衡被打破，两相形成细小的液滴，能够增大传质面积，减小传质阻力。但过高的转速导致剪切力过大，从而破坏细胞的完整性，会导致AD的生成量反而变小^[7]。

图 4(Fig. 4)

图 4 摇床转速对AD生产的影响 Fig.4 Influence of rotational speed on AD production (phytosterols 1 g⋅L-1, Tween 40 1% (V/V))

由于甾醇化合物显著的疏水性，使得底物的投料浓度偏低，最初双水相体系用于胆固醇降解时底物的投料只有1 g⋅L^-1[10]。但是大规模生产AD的过程中，对底物的初浓度和产物的终浓度要求较高。如图 5所示，产物浓度随底物浓度增加而增大，底物浓度从1 g⋅L^-1增加到20 g⋅L^-1时，产物的浓度从0.5 g⋅L^-1增加到1.6 g⋅L^-1。据文献报道^[23]，底物浓度高于8 g⋅L^-1时，对细胞产生明显的抑制作用，细胞活性降低，限制了产物的终浓度。但在双水相体系中，即使底物浓度达到10 g⋅L^-1，产物浓度依然相应增加。这种现象可能是因为植物甾醇在双水相中溶解度具有一定的改善。但是，随着底物浓度的进一步增大，AD浓度没有成比例提高。这是由于溶液的黏度随着底物浓度的增大而增加，影响了氧传递速率。在好氧发酵中，氧气作为电子和氢的受体，能够显著影响分枝杆菌对植物甾醇的利用^[23]。因此，在萃取发酵的过程中，底物投料需要维持在合适的浓度范围内。

图 5(Fig. 5)

图 5 不同投料浓度下的植物甾醇转化过程 Fig.5 Bioconversion of phytosterols to produce AD in ATPS with different substrate feeding concentrations (Tween 40 1% (V/V))

实验室条件下，将双水相体系的规模初步放大到200 g，结果如图 6所示。发酵规模为50 g和100 g时，AD浓度稍有降低，可能是装液量增大影响了溶氧。随着发酵体积的进一步增大，转化结果趋于稳定。最终，对双水相萃取发酵体系200 g规模，底物投料浓度为10 g⋅L^-1、分枝杆菌发酵96 h后产物AD的浓度达到1.1 g⋅L^-1，为双水相体系用于萃取发酵的工业化生产积累了基础数据。

图 6(Fig. 6)

图 6 双水相体系用于甾醇萃取生物转化的初步放大实验 Fig.6 Tentative scale-up of aqueous two-phase systems for extractive bioconversion of phytosterols (phytosterols 10 g⋅L-1, Tween 40 1% (V/V))

萃取发酵是解决发酵过程中产物抑制、提高产率的一种有效手段。通过考察合适的双水相体系，最终确定7% (wt) PEG 6000/8% (wt) 葡聚糖70000的双水相体系应用于分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产AD。该双水相易于放大，实验室操作条件可以直接应用到工业化生产。发酵体系为200 g时，将底物投料浓度提高到10 g⋅L^-1，产物浓度可达到1.1 g⋅L^-1。但是，双水相的工业化应用需要考虑成相聚合物的成本，目前葡聚糖成相聚合物的价格高昂，限制了双水相的大规模应用。一方面可以寻求廉价且生物相容性好的聚合物如淀粉或纤维素的衍生物代替葡聚糖^[7]，另一方面可以通过超滤等手段回收聚合物^[7]从而降低生产成本。