近年来，随着生物技术的快速发展，基因治疗在生物医药领域越来越受到关注，目前已有多个基因治疗产品获得美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA)批准[1]。
质粒DNA(pDNA)是一种小型环状DNA，在基因治疗中可以作为DNA疫苗直接参与疾病防控，也可以作为病毒载体或mRNA等药物的生产原料[2]。pDNA存在三种不同构象：超螺旋(supercoiled，sc)，开环(open circular，oc)和线性(linear，ln)。作为基因治疗药物，pDNA存在转染效率低的缺点，大约1 000个分子中只有1个能进入细胞并被表达[3]。研究表明，超螺旋质粒DNA (supercoiled plasmid DNA，sc pDNA)具有更高的细胞转染效率[4]，因此，如何制备高同质性即高超螺旋比例的pDNA是关键。FDA对pDNA产品中杂质含量做了详细规定[5]，其中RNA因电荷和疏水性存在较大差异而较容易分离，oc pDNA和sc pDNA相对分子质量及总带电量相近，差别仅在于局部电荷密度以及sc pDNA过旋引起的碱基暴露[6]，因此如何有效分离oc pDNA和sc pDNA成为pDNA纯化过程的关键。
pDNA分离方法有沉淀[7]、膜分离[8]、双水相萃取[9]、固相萃取[10]、磁性纳米颗粒吸附[11]等，但普遍存在分离效果有限、收率低等问题，而层析具有更精细的分离效果。Valente等[12]使用精氨酸大孔亲和层析，从澄清的细胞裂解液中分离出pcDNA3-FLAG-p53(碱基对数量为6 070 bp)，采用NaCl浓度cNaCl=120 mmol·L−1的洗脱液使oc pDNA和RNA洗脱，再升高cNaCl至160 mmol·L−1使sc pDNA洗脱，得到的sc pDNA纯度为92%，但收率仅为43%；作者进一步通过试验设计法(DoE)优化制备了O-磷-L-酪氨酸介质，sc pDNA纯度提高到98.2%，但收率仍只有49.7% [13]。Santos等[14]采用L-酪氨酸作为亲和配基分离pPH600质粒(碱基对数量为3 562 bp)，纯度为98.2%、收率为56.3%，但介质的动态载量较低。Bicho等[15]采用乙二胺作为离子交换配基制备整体柱用于pDNA分离，sc pDNA纯度为97.1%、收率为47.0%。疏水相互作用层析也有报道[16]，可达到98%的同质性和96%的收率，但需要偶联其他分离步骤。整体而言，sc pDNA分离仍有较大挑战，难以同时达到高纯度与高收率。
混合模式层析是一种兼有多种分子相互作用的新型层析分离方法[17-20]。pDNA分离涉及的3种主要核酸成分既有荷电性质的差异，也有疏水性的差异，因而利用混合模式层析纯化更具有优势。Silva-Santos等[21]使用Capto adhere介质，得到92.2%同质性的sc pDNA；又采用胍丁胺整体柱，获得纯度为98.3%的sc pDNA，收率为51.8%[22]。近些年新推出的混合模式介质Capto PlasmidSelect是以2-巯基吡啶为配基，兼有离子和疏水相互作用，对sc pDNA具有较好的选择性。本研究针对sc pDNA分离，采用Capto PlasmidSelect作为混合模式介质，澄清的细胞裂解液直接上样，考察该介质对分离过程中主要成分sc pDNA、oc pDNA和RNA的吸附和分离性能，优化冲洗、洗脱、上样量等分离条件，实现sc pDNA的高效分离。
2 材料与方法 2.1 材料混合模式介质Capto PlasmidSelect，Cytiva公司；质粒pVAX1(碱基对数量为3.0 kbp)，武汉淼灵生物科技有限公司；质粒纯化中量试剂盒，上海生工生物工程有限公司；CIMac pDNA分析柱，BIA Separations公司；超滤离心管(0.5 mL，截留分子量为10 000)，Millipore公司；其他试剂为市售分析纯。AKTA层析系统，GE Healthcare公司。
2.2 菌体培养取少量经pVAX1转化的DH5α大肠杆菌，在含有卡那霉素100 mg·mL−1的固体溶菌肉汤(LB)培养基上37 ℃下活化24 h，挑取单菌落经两级扩大培养，以2%的接种量接入250 mL、含100 mg·mL−1卡那霉素的液体LB培养基，在220 r·min−1、37 ℃条件下摇床培养12~16 h。
2.3 pDNA初步提取采用改良的碱裂解法进行pDNA初步分离。细菌培养液经4 000 r·min−1离心30 min，取沉淀物用10 mL溶液I(葡萄糖浓度cGlu=50 mmol·L−1、三羟甲基氨基甲烷浓度cTris= 25 mmol·L−1、乙二胺四乙酸浓度cEDTA=10 mmol·L−1，pH=8.0)重悬，加入15 mL溶液II(cNaOH = 0.2 mol·L−1、SDS的质量浓度为0.01g·mL−1)进行裂解，室温下放置5 min，立即加入12 mL溶液III(醋酸钾浓度cKAc= 3 mol·L−1，pH=5.5)中和，此时产生大量絮状沉淀。冰浴20 min，10 000 r·min−1下离心30 min，取上清液加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置30 min使其充分沉淀，10 000 r·min−1下离心20 min，将收集到的沉淀物用少量质量分数为70%的乙醇洗涤，自然挥发掉多余的乙醇。用5 mL、cTris=10 mmol·L−1的Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)重悬，加入(NH4)2SO4至c(NH4)2SO4= 2.5 mol·L−1，冰浴15 min使部分RNA和蛋白质析出，10 000 r·min−1下离心20min，得到上清液作为初分离料液，用于后续分离。料液中含有sc pDNA 0.82 mg·mL−1、oc pDNA 0.16 mg·mL−1和RNA 1.63 mg·mL−1。
2.4 静态吸附测定取适量Capto PlasmidSelect介质，用去离子水充分清洗，抽干后用c(NH4)2SO4= 2.5 mol·L−1、cTris=10 mmol·L−1的缓冲液(pH=7.5)平衡30 min，再抽滤15 min。称取约0.03 g介质置于2 mL离心管，将上述初分离料液pH值调至7.5，稀释成8种不同浓度，分别取0.8 mL加入装有介质的离心管，25℃、1 200 r·min−1下恒温混匀仪振荡3 h，充分吸附达到平衡；3 000 r·min−1下离心2 min，使吸附介质沉降，得到上清液，经孔径为0.22 μm的滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)分析各组分的平衡质量浓度ρ(μg·mL−1)。根据物料衡算得到sc pDNA、oc pDNA和RNA这3种核酸的吸附量Q(mg·g−1)，采用Langmuir吸附平衡式对吸附等温线进行拟合，得到饱和吸附量Qm(mg·g−1)和结合常数Ka(mL·μg−1)，具体如下：
| $ Q=\frac{\rho Q_{\mathrm{m}}}{\rho+1 / K_{\mathrm{a}}} $ | (1) |
将Capto PlasmidSelect介质1 mL装填于Tricorn 5/50层析柱(Cytiva公司)。初分离料液pH值调至7.5，经孔径为0.45 μm的滤膜过滤后作为上样料液，上样流速为200 cm·h−1。上样前用c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1的平衡缓冲液(pH=7.5)充分平衡介质，上样后收集流穿组分，用HPLC分析流穿液中sc pDNA、oc pDNA和RNA的质量浓度，分别绘制穿透曲线，计算10% 穿透时的动态载量。上样完成后，用cEDTA=10 mmol·L−1、cTris=100 mmol·L−1的缓冲液(pH=7.5)洗脱，并用cNaOH =1 mol·L−1的清洗液进行清洗再生。
2.6 分离条件优化用cEDTA=10 mmol·L−1、cTris=100 mmol·L−1的缓冲液(pH=7.5)配制5种不同浓度的(NH4)2SO4与NaCl的混合盐溶液(如1.5 mol·L−1(NH4)2SO4与0.5 mol·L−1 NaCl混合溶液，其他配比为1.6+0.4、1.7+0.3、1.8+0.2、1.9+0.1)作为洗脱液。首先以 c(NH4)2SO4=2 mol·L−1、cTris=100 mmol·L−1的缓冲液(pH =7.5)作为冲洗液，考察上述混合盐洗脱液的浓度对洗脱效果的影响，即收集洗脱液，HPLC分析sc pDNA纯度、同质性和收率。确定洗脱条件后，进一步考察冲洗条件和不同上样量(2、5、10 mL)对纯化效果的影响。
2.7 凝胶电泳称取0.4 g琼脂粉溶于50 mL 1xTAE缓冲液制成凝胶，加入体积分数为1%的核酸染料4S Green Plus。样品上样量为6 μL (5 μL样品+1 μL DNA上样缓冲液)，DNA Marker上样量为5 μL，110 V恒压电泳35 min，黑暗条件紫外灯下观察电泳条带并拍照，用Image J软件对图像进行分析。
2.8 HPLC分析分析柱为CIMac pDNA 0.3 mL Analytical Column，上样条件为cNaCl=0.725 mol·L−1、cTris=10 mmol·L−1、pH=8.0，洗脱梯度设置为cNaCl=0.725~0.85 mol·L−1，最后用cNaCl=1 mol·L−1的溶液进行再生。流量为1 mL·min−1，上样体积为20 μL，检测波长为260 nm，室温下进行。sc pDNA的纯度和同质性计算式如下：
| $ \text { Purity }=\frac{A_{\mathrm{sc}}}{A_{\mathrm{all}}} $ | (2) |
| $ \text { Homogenity }=\frac{A_{\mathrm{sc}}}{A_{\mathrm{sc}}+A_{\mathrm{oc}}} $ | (3) |
式中：Asc、Aoc、Aall分别为sc pDNA、oc pDNA和全部峰面积。
3 结果与讨论 3.1 静态吸附性能初分离料液中含有sc pDNA、oc pDNA，以及未去除完全的RNA和少量其他杂质，下面考察Capto PlasmidSelect介质对不同组分的静态吸附情况。根据预实验的结果，首先选择c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1、cTris=10 mmol·L−1的缓冲液(pH=7.5)。为了考察盐浓度对吸附的影响，还比较了c(NH4)2SO4=1.9 mol·L−1时的吸附，具体结果见图 1~3。由图 1可见，两种盐浓度下的Qm比较接近，分别为3.3和3.4 mg·g−1，这表明盐浓度对sc pDNA吸附影响较小。但结合常数Ka有差异，比较3个组分吸附情况，可以发现c(NH4)2SO4从2.5降到1.9 mol·L−1时，sc pDNA吸附量略有增高，而oc pDNA和RNA则有所降低，原因可能在于本研究采用的是混合模式介质，配基为2-巯基吡啶，与目标物结合存在疏水、静电和亲硫等复杂作用，sc pDNA、oc pDNA、RNA在电荷密度(sc pDNA > oc pDNA > RNA)及疏水性(RNA > sc pDNA > oc pDNA)方面存在差别，因此，随盐浓度增大，sc pDNA呈现与oc pDNA和RNA不同的变化趋势。
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图 1 Capto PlasmidSelect介质对sc pDNA的吸附等温线(pH=7.5) Fig.1 Adsorption isotherm curves of sc pDNA on Capto PlasmidSelect resin at pH=7.5 |
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图 2 Capto PlasmidSelect介质对oc pDNA的吸附等温线(pH=7.5) Fig.2 Adsorption isotherm curves of oc pDNA on Capto PlasmidSelect resin at pH=7.5 |
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图 3 Capto PlasmidSelect介质对RNA的吸附等温线(pH=7.5) Fig.3 Adsorption isotherm curves of RNA on Capto PlasmidSelect resin at pH=7.5 |
根据上述结果，当初分离料液中c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1时，可直接作为上样料液，此时，目标物sc pDNA有较好的吸附能力；c(NH4)2SO4=1.9 mol·L−1的溶液可作冲洗液，能去除大部分oc pDNA，从而提高sc pDNA的分离效果。由于RNA在c(NH4)2SO4=2.5或1.9 mol·L−1的溶液中都具有较高的结合能力，故尚需优化洗脱，以便更好地进行核酸分离。
3.2 动态吸附性能在静态吸附结果基础上，进一步考察pH=7.5、c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1的含pDNA的料液动态载量，选择线性流速为200 cm·h−1，三组分的穿透曲线如图 4所示，ρ0为上样料液的质量浓度，mg·mL−1。由图可见，sc pDNA和oc pDNA达到10%穿透的时间相近，其中oc pDNA略早一些，表明二者可能不存在竞争性吸附。相对而言，sc pDNA穿透曲线更平缓，表明吸附能力强，这可能与超螺旋结构空间位阻较小有关。sc pDNA的动态载量为每毫升介质负载2.00 mg，oc pDNA为每毫升介质负载0.32 mg。图中还可以发现，当sc pDNA和oc pDNA接近饱和吸附状态时，RNA仅有少量穿透(小于5%)，这与3.1节的静态吸附结果一致，表明RNA对pDNA吸附没有显著影响，推测RNA吸附有可能为非特异性吸附，并不占据pDNA的吸附位点。
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图 4 200 cm·h−1流速下Capto PlasmidSelect介质对sc pDNA、oc pDNA和RNA的穿透曲线 Fig.4 Breakthrough curves of sc pDNA, oc pDNA and RNA on Capto PlasmidSelect resin at 200 cm·h−1 linear velocity |
根据sc pDNA、oc pDNA和RNA在电荷密度(sc pDNA > oc pDNA > RNA)及疏水性(RNA > sc pDNA > oc pDNA)方面的差异，以及预实验结果，发现对于混合模式介质Capto PlasmidSelect，适当的c(NH4)2SO4可以促进sc pDNA结合，降低c(NH4)2SO4和添加少量NaCl可以改变sc pDNA和oc pDNA与介质的结合状态。因此，选择在c(NH4)2SO4=2 mol·L−1与(c(NH4)2SO4=1.5 mol·L−1)+(cNaCl=0.5 mol·L−1)之间设置等梯度的洗脱条件，以便考察不同盐浓度对sc pDNA纯度、同质性和收率影响。上样2 mL、c(NH4)2SO4=2 mol·L−1下冲洗，不同盐浓度的等梯度洗脱曲线见图 5，AUV, 260nm表示260 nm下的紫外响应值。由图可见，(c(NH4)2SO4=1.9 mol·L−1)+(cNaCl=0.1 mol·L−1)条件下，sc pDNA无法洗脱。随着c(NH4)2SO4降低以及cNaCl升高，洗脱条件逐渐苛刻，质粒峰后会跟随一个不可忽略的峰，如图中(c(NH4)2SO4=1.5 mol·L−1)+(cNaCl=0.5 mol·L−1)时的曲线，经电泳分析发现该峰富含RNA，从而影响sc pDNA纯度。此外，发现不同盐浓度洗脱条件对sc pDNA的同质性无显著影响。综合比较纯度、同质性和收率(见图 6)，选择(c(NH4)2SO4=1.7 mol·L−1)+(cNaCl= 0.3 mol·L−1)为最佳洗脱条件，此时sc pDNA纯度为80.9%、同质性达到91.5%、收率为73.7%。
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图 5 不同盐浓度的洗脱HPLC谱图 Fig.5 HPLC chromatogram of the elution step under different molar salt concentrations |
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图 6 不同盐浓度的洗脱效果比较 Fig.6 Comparison of elution effect under different molar salt concentrations |
最佳洗脱条件下sc pDNA、oc pDNA和RNA三组分的层析分离结果见图 7。由图可见，在洗脱开始阶段，oc pDNA少量解吸，然后sc pDNA大量洗脱，因此收集洗脱液应以oc pDNA的小峰之后、sc pDNA峰之前为起点。RNA始终有一个小的洗脱平台，只在sc pDNA之后才大量洗脱。综合考虑收率和纯度，确定合适的收集洗脱液区间应为sc pDNA出峰之后的2~3 mL。
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图 7 sc pDNA、oc pDNA和RNA的层析分离图谱(2 mL上样) Fig.7 Chromatogram of sc pDNA, oc pDNA and RNA separation with 2 mL loading volume |
上述结果表明，c(NH4)2SO4=2.0 mol·L−1下的冲洗效果不佳。为了减少洗脱液收集组分中oc pDNA含量，需进一步对冲洗阶段盐浓度进行优化。不同c(NH4)2SO4下冲洗的层析分离谱图如图 8所示。由图可见，将冲洗液中c(NH4)2SO4由2.0 mol·L−1略微降低至1.9 mol·L−1，可以冲洗出更多的oc pDNA，同时不会影响sc pDNA。原本在洗脱阶段才能解吸的部分oc pDNA在冲洗过程中被去除，降低了洗脱峰中杂质oc pDNA的含量。优化后，洗脱峰中sc pDNA纯度从80.9%提高至87.6%、同质性从91.5% 提高至95.7%、收率则基本保持不变。
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图 8 不同盐浓度冲洗的层析分离谱图 Fig.8 Chromatogram of washing step under different molar salt concentrations |
根据动态吸附实验结果，合适的上样量为5~10 mL，既达到较大处理量，又避免了sc pDNA穿透。采用优化的冲洗和洗脱条件，比较了不同上样量的sc pDNA分离结果(见图 9)。由图可见，上样量从2 mL增大到5 mL，对各组分的吸附和洗脱分离行为没有显著影响，仅仅为量级的差别。当上样量继续增大至10 mL时，冲洗峰出现异常增大，洗脱峰也较预期偏小。再通过HPLC分析(见图 10)发现，冲洗峰中含有大量sc pDNA，导致收率显著降低到59.2%。可能原因是，随上样量增大，部分sc pDNA处于弱结合状态，导致容易被冲洗掉而影响收率。
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图 9 不同上样量的层析分离谱图 Fig.9 Chromatogram of MMC separation under different loading amounts |
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图 10 不同上样量下冲洗峰的HPLC分析比较 Fig.10 HPLC analysis of washing peaks under different loading amounts |
最终确定最佳上样量为5 mL，此时核酸分离得到sc pDNA纯度为83.9%、同质性达到95.8%、收率为80.6%。Valente等[12]采用精氨酸大孔介质从细菌裂解液中分离pDNA，得到纯度为92%的sc pDNA，但收率仅为43%，动态载量也仅有每毫升介质负载0.256 mg。Bicho等[15]使用乙二胺整体柱，分离得到纯度为97.1% 的sc pDNA，收率仅为47.0%，且处理体积仅为20 μL，单次获得的总sc pDNA量仅为2.55 μg，而本研究单次可获得sc pDNA约为每毫升介质负载0.465 mg。与文献相比，本研究获得的sc pDNA纯度较低，主要是由于初分离料液中RNA含量较大，造成洗脱过程中RNA的部分解吸，后续可通过初分离去除RNA或后续核酸分离提高sc pDNA纯度。
4 结语采用新型混合模式层析介质Capto PlasmidSelect分离料液中的sc DNA。探讨了料液中主要组分sc pDNA、oc pDNA和RNA的吸附行为，测定了其动态载量，并优化了层析分离过程冲洗、洗脱条件及上样量。在c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1条件下，成分较为复杂的料液中sc pDNA的饱和吸附量达到每克介质吸咐3.3 mg，故料液可不进行额外处理，直接上样分离。200 cm·h−1流速下sc pDNA的动态载量为每毫升介质负载2.00 mg，而oc pDNA为每毫升介质负载0.32 mg。优化的分离条件为：pH=7.5、c(NH4)2SO4=2.5 mol·L−1下上样，上样量为5 mL；pH=7.5、c(NH4)2SO4=1.9 mol·L−1下冲洗，最佳洗脱盐浓度(c(NH4)2SO4=1.7 mol·L−1)+(cNaCl= 0.3 mol·L−1)，可得到sc pDNA纯度为83.9%、同质性高达95.8%、收率为80.6%。结果表明，采用混合模式层析介质Capto PlasmidSelect一步分离sc pDNA效果显著、选择性好、处理量较大，具有良好的应用前景。
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