单克隆抗体(简称单抗，mAb)是最重要的生物技术药物，具有靶向性好、疗效高、毒副作用小等特点，已有超过70种单抗类药物被批准上市[1-2]。对于抗体生产，随着上游细胞表达量增长和生产规模扩大[3-6]，下游分离过程的高效性、经济性和稳健性越来越受到关注，新型分离过程的研发成为热点[7]。基于蛋白A亲和捕获的三步层析工艺是单抗制备的平台技术，不过，常规批次层析分离的过程效率有限，难以匹配快速增长的上游产量。另一方面，蛋白A亲和介质价格昂贵，其成本约占下游过程的35%[8-12]。提高产能和降低成本是下游过程变革的关键，若改批次层析为连续分离过程，可提高蛋白A亲和介质的介质利用率和产率，降低缓冲液消耗，从而降低生产成本。
连续分离技术由Broughton在1961年提出，主要采用模拟移动床(simulated moving bed，SMB)进行小分子分离[13]。1992年起SMB技术开始应用于手性化合物和食品工业中糖类物质的分离[14-20]。之后，基于SMB原理，多项连续分离技术相继开发并应用于生物大分子分离，通常称为连续流层析(continous chromatography)。不同连续流层析系统主要区别在于层析柱的使用数量和操作模式。Novasep公司的BioSC系统采用SMCC (sequential multi-column chromatography)技术，利用多柱串联(2~6柱)方式进行免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)亲和分离，通过建立模型、优化操作参数，产量提高了38%[21]。ChromaCon公司的CUBE系统应用Capture SMB技术，采用双柱连续流层析对IgG进行分离，考察不同蛋白浓度及层析柱长度，优化发现连续层析产率比批次层析增加了35%，介质利用率提高了45%[22-23]。GE Healthcare公司根据层析介质的载量及工艺参数的不同提出3C-PCC和4C-PCC(periodic counter-current chromatography)技术，使用3柱或者4柱进行连续流层析，单抗亲和分离的介质利用率和缓冲液消耗量均优于批次层析过程[24-26]。Pall公司的BioSMB系统将一次性技术和连续流层析技术相结合，根据工艺需要层析柱数可从3柱增加到16柱，亲和捕获抗体的介质利用率显著提高，缓冲液消耗大幅度降低，生产成本降低了约30%[27-28]。总的来说，与批次层析过程相比，不同操作模式的连续流层析的产率和介质利用率均有明显提高，缓冲液消耗大幅度下降，分离成本降低。目前，部分连续流层析工艺已完成中试，结果表明相关技术具有良好的线性放大特性，显示出广阔的应用前景[29-30]。
与常规批次层析相比，连续流层析过程较为复杂，特别是新型的双柱连续流层析，合适的操作参数和合理的过程设计是提高过程效率的关键，可是文献中对于操作参数的考察均不够完善，也未提出明确的过程设计策略。因此，针对双柱连续流层析，本文以两种蛋白A亲和介质(MabSelect SuRe和UniMab)为典型对象，考察不同保留时间和蛋白浓度条件下IgG的穿透行为；依据穿透曲线进行连续流层析工艺设计，考察系列因素对产率和介质利用率的影响，确定合适的分离条件；最后应用于细胞培养液中捕获单抗，考察连续流层析工艺的可行性。
2 双柱连续流层析原理图 1是蛋白穿透曲线示意图，横坐标为上样体积，纵坐标为层析柱流出液蛋白浓度，虚线标注为动态结合载量（dynamic binding capacity，DBC）。图中曲线以上部分(A+B+C)代表介质的最大吸附量，曲线以下部分(D)则代表流穿的蛋白量。对于常规批次层析，上样量通常选择在蛋白1%穿透点（如图中V1所示），此时流穿部分较少，避免目标蛋白损失，但介质的利用率较低，仅A部分吸附容量被利用。对于双柱连续流层析，两根层析柱串联上样(见图 2的Step 1)，使用第二根层析柱承接并吸附从第一根层析柱中流穿的蛋白，因此第一根层析柱可以持续上样到更高的蛋白穿透点（如图中VX所示），从而显著提高层析柱的载量(对应于图 1中A+B)，进而提高介质利用率。该策略对于价格昂贵的介质和穿透曲线比较平坦的体系尤为重要，如蛋白A亲和分离捕获抗体时。
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图 1 蛋白穿透曲线示意图 Fig.1 Schematic diagram of a breakthrough curve in protein chromatographic separation |
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图 2 连续流层析分离过程示意图 Fig.2 Schematic diagram of a continuous chromatographic process |
双柱连续流层析的具体步骤如图 2所示。首先是两根层析柱(1#和2#)以串联方式上样(如图 2中Step 1)，称为连接模式(interconnect，IC)上样，1#层析柱流穿的蛋白被2#层析柱吸附；当1#层析柱达到设定的穿透点，将1#层析柱未吸附的蛋白冲洗到2#层析柱(如图 2中Step 2)；然后将两根层析柱断开，1#层析柱进行淋洗、洗脱、再生、再平衡等步骤，与此同时2#层析柱上样直至1%蛋白穿透(如图 2中Step 3所示)，该过程称为断开模式(disconnect，DC)，通常此时2#层析柱的上样流速比连接模式上样时的流速低，以保证此阶段内蛋白不会从2#层析柱中流穿；待1#层析柱完成所有洗脱和再生步骤(recovery-regeneration，R-R)，将1#层析柱串联至2#层析柱后，2#层析柱持续上样，该过程与Step 1的连接模式上样类似，只是两层析柱调换了位置；然后重复以上Step 2和Step 3步骤，即图 2中Step 5和Step 6。从Step 1到Step 6完成了一个循环，如此通过双柱交替上样，便可以实现连续层析分离。
为使系统快速达到稳定状态，通常会在最前面添加一个启动阶段，即将两根层析柱串联上样，终点为上述循环操作的起始点，即1#层析柱1%穿透。此外，一般会在连续流层析分离结束前添加一个终止阶段，将最后一个循环中2#层析柱承接的蛋白进行分离操作。
3 材料和方法 3.1 主要材料与仪器双柱连续流层析系统，Contichrom®CUBE Combined，瑞士ChromaCon AG公司；MabSelect SuRe预装柱，1mL，购自GE Healthcare公司；UniMab预装柱，1mL，苏州纳微科技股份有限公司；静注人免疫球蛋白(hIgG，50 mg·mL-1)，分子量约150 kDa(1000g·mol-1)，华兰生物工程重庆有限公司；中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary, CHO)细胞培养上清液，单抗浓度约2.8 mg·mL-1；OneDrop OD-1000+分光光度计，南京五义科技有限公司；高效液相色谱仪LC3000，北京创新通恒科技有限公司；宿主细胞蛋白检测试剂盒CHO HCP ELISA Kit 3G，Cygnus公司；其他试剂均为分析纯。
3.2 实验方法 3.2.1 蛋白穿透曲线测定蛋白穿透实验采用前沿分析法，比较MabSelect SuRe和UniMab两种1 mL预装柱。样品采用hIgG，用平衡缓冲液(20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 7.4，0.15 mol·L-1 NaCl)稀释至一定浓度，调节至pH 7.4。首先用5倍柱体积(column volume，CV)平衡缓冲液平衡层析柱，然后进行蛋白上样，紫外检测器280 nm在线监测层析柱出口的蛋白浓度，得到穿透曲线。采用2 mg·mL-1的hIgG溶液作为上样液，考察不同保留时间(0.5、1、2、3、4 min)的穿透曲线；以及在保留时间1 min条件下，考察不同蛋白浓度(0.5、1、2、5和10 mg·mL-1)的穿透曲线。
3.2.2 批次层析分离批次层析分离的工艺条件通过前期优化得到。首先用5 CV平衡缓冲液平衡层析柱，上样量根据1%蛋白穿透的80%确定。上样结束后，用4 CV平衡缓冲液冲洗，然后用4 CV高盐缓冲液(20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 6.0，1.0 mol·L-1 NaCl)淋洗，再用3 CV平衡缓冲液冲洗，然后用5 CV柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 3.0)进行洗脱，3 CV醋酸溶液(1.0 mol·L-1)充分清洗，2 CV平衡缓冲液平衡层析柱，再用0.1 mol·L-1 NaOH对层析柱再生15 min，最后用5CV平衡缓冲液进行平衡。分离过程中上样的保留时间与3.2.1节穿透实验保持一致，冲洗步骤步骤的保留时间与上样一致，再生步骤的保留时间固定为3 min，其他步骤(包括平衡、淋洗、洗脱等)的保留时间都为0.5 min。
3.2.3 双柱连续流层析分离双柱连续流层析的设计参数主要包括连接模式(如图 2中Step 1)和断开模式(如图 2中Step 3)的上样流速uIC、uDC及相应操作时间tIC、tDC。在断开模式阶段，前柱的淋洗、洗脱和再生等步骤的操作参数与3.2.2节批次层析过程相同，因此tDC可通过批次层析的工艺来确定。其余参数需要依据穿透曲线进行优化设计。对于连接模式上样阶段，两根层析柱通过串联方式上样至2#层析柱1%穿透，从1#层析柱中穿透的蛋白会被2#层析柱吸附，这部分穿透的蛋白量称为2#层析柱的预上样量(QPL)，对应于图 1中的区域D，QPL可以通过式(1)计算：
| $ {{Q}_{\text{PL}}}\text{=}\frac{{{A}_{{{\text{V}}_{\text{min}}}}}\cdot {{c}_{\text{feed}}}}{{{V}_{\text{col}}}} $ | (1) |
式中，cfeed表示蛋白浓度，Vcol表示柱体积，AVmin表示第一根层析柱穿透曲线从0至Vmin的积分，Vmin为V80%_1C和V1%_2C二者中的较小值。在实际分离过程中，可能会出现两种情况：当保留时间较短或蛋白浓度较高时，如图 3(a)所示，V80%_1C > V1%_2C，此时连接模式的上样终点可选择在2#层析柱1%穿透点，即V1%_2C，；当保留时间较长或蛋白浓度较低时，如图 3(b)所示，1#层析柱需要达到接近100%穿透时，2#层析柱才开始穿透，若仍按照2#层析柱1%穿透点设置上样终点不是很合理，一般选择1#层析柱80%穿透时停止上样。
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图 3 双柱串联上样的穿透曲线 Fig.3 Breakthrough curves of protein loading with two columns in series V1%_1C: 1% breakthrough of the first column; V80%_1C: 80% breakthrough of the first column; V1%_2C: 1% breakthrough of the second column |
对于断开模式的上样阶段(如图 2中Step 3的下图)，2#层析柱会持续上样至1%穿透，这部分的上样量QDL可通过式(2)计算：
| $ Q{}_{{\rm{DL}}}{\rm{ = }}\frac{{{V_{1{\rm{\% \_}}1{\rm{C}}}} \cdot {c_{{\rm{feed}}}}-Q{}_{{\rm{PL}}}}}{{{V_{{\rm{col}}}}}} \cdot Z $ | (2) |
式中，Z 表示安全系数，依据建议设为0.9。
断开模式上样阶段的上样流速uDC则可以通过式(3)计算：
| $ {u_{{\rm{DC}}}}{\rm{ = }}\frac{{{Q_{{\rm{DL}}}} \cdot {V_{{\rm{col}}}}}}{{{c_{{\rm{feed}}}} \cdot {t_{{\rm{DC}}}}}} $ | (3) |
连接模式上样阶段的上样流速uIC依据保留时间设定，该阶段所需时间tIC可由式(4)计算：
| $ {t_{{\rm{IC}}}}{\rm{ = }}\frac{{{V_{{\rm{min}}}}-{V_{1\% \_1{\rm{C}}}}}}{{{u_{{\rm{IC}}}}}} $ | (4) |
连续流层析中冲洗阶段为连接模式冲洗(如图 2中Step 2)，冲洗液4 CV，采用连接模式上样相同的流速；其他步骤(包括淋洗、洗脱、再生等)采用断开模式，操作参数与3.2.2节中批次层析实验过程相同。
3.2.4 细胞培养液中分离单抗经过上述hIgG模型蛋白的优化实验，选择合适的双柱连续流层析操作条件，从CHO细胞培养液中分离单抗，料液含单抗2.8 mg·mL-1。首先进行料液的穿透实验，穿透组分采用分布收集，通过体积排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)检测收集液的单抗含量，得到穿透曲线，确定介质对单抗的动态载量。其次进行批次层析分离，方法与3.2.2节基本相同，上样量为1%穿透的80%，将三步淋洗的体积增加至5 CV，洗脱缓冲液pH由3.0改为3.5，洗脱液用预装有500 μL的2.0 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液进行中和。最后，进行双柱连续流层析分离，过程设计按照3.2.3节方法，淋洗、洗脱和再生等步骤的操作条件与批次层析过程保持一致。
3.2.5 分析方法纯hIgG溶液浓度由OneDrop OD -1000+分光光度计测定；单抗浓度及纯度由SEC-HPLC分析，色谱柱为TSK G3000SWXL，流动相为0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(含1%异丙醇)，流速为0.5 mL·min-1；宿主细胞蛋白(HCP)含量通过ELISA方法测定，具体方法参照试剂盒说明书。
3.2.6 分离过程评价比较批次层析和连续流层析的分离性能，包括单抗纯度、收率和HCP含量，以及过程参数指标，产率P、介质利用率CU和缓冲液消耗BC，具体计算如下。
(1) 产率P
批次层析的产率PBatch计算如式(5)：
| $ {P_{{\rm{Batch}}}}{\rm{ = }}Y \cdot \frac{{c \cdot {V_{\rm{L}}}}}{{{t_{{\rm{all}}}}{V_{{\rm{col}}}}}} $ | (5) |
式中，Y表示收率，tall表示整个层析过程需要的时间；c为单抗浓度；VL表示上样体积；Vcol表示柱体积。
连续流层析的产率PC可通过式(6)计算：
| $ {P_{\rm{C}}}{\rm{ = }}Y \cdot \frac{{c \cdot \left( {{t_{{\rm{DC}}}}{u_{{\rm{DC}}}} + {t_{{\rm{IC}}}}{u_{{\rm{IC}}}}} \right)}}{{2{V_{{\rm{col}}}}\left( {{t_{{\rm{DC}}}} + {t_{{\rm{IC}}}} + {t_{{\rm{wash}}\;{\rm{1}}}}} \right)}} $ | (6) |
式中，twash 1表示层析过程中wash 1阶段的时间，见图 2中Step 2。
(2) 介质利用率CU
介质利用率CU计算如式(7)：
| $ {\rm{CU = }}{Y} \cdot \frac{{\int_0^{{V_{\rm{L}}}} {\left( {1 - C/{C_0}} \right){\rm{d}}{V}} }}{{\int_0^{{V_{100\% \_1{\rm{C}}}}} {\left( {1 - C/{C_0}} \right){\rm{d}}{V}} }} $ | (7) |
式中，VL表示批次层析或连续流层析过程中的上样体积，V100%_1C表示100%穿透时上样体积。
(3) 缓冲液消耗BC
缓冲液消耗BC由式(8)计算：
| $ {\rm{BC}}{\rm{ = }}\frac{{{V_{{\rm{B\_all}}}}}}{{Y \cdot {c_{{\rm{feed}}}}{V_{\rm{L}}}}} $ | (8) |
式中，VB_all表示整个层析过程中平衡、淋洗、洗脱、再生等步骤所消耗缓冲液的总体积。
4 结果与讨论 4.1 动态载量比较考察了两种蛋白A亲和介质MabSelect SuRe和UniMab在不同保留时间和不同IgG浓度下的穿透曲线。两种介质呈现相同的规律，不同蛋白浓度的穿透曲线都较为接近，即在一定浓度范围内IgG浓度对蛋白A亲和介质的穿透行为影响较小。UniMab介质在不同保留时间的穿透曲线如图 4所示，随着保留时间减小，流速增大，穿透曲线变得平缓，穿透点前移，动态载量下降，与文献报道[31-32]相似。两种介质的动态载量比较如图 5所示，可以发现UniMab具有较高的动态载量，特别是在高流速下(低保留时间)gq更加明显。
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图 4 UniMab介质在不同保留时间条件下的IgG穿透曲线 Fig.4 Breakthrough curves of IgG at different residence times with UniMab |
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图 5 两种介质不同保留时间的动态载量比较 Fig.5 Dynamic binding capacities of the two resins under different residence times |
根据不同操作条件下的穿透曲线可以确定介质的动态载量，并用于连续流层析过程的设计，具体见3.2.3节。实际分离过程中，选择合适的穿透点非常重要，本文选择80%作为最大穿透量。以UniMab介质为例，不同IgG浓度和保留时间的操作参数如表 1所示。可以发现，在保留时间较长(> 1 min)或蛋白浓度较低(< 2 mg·mL-1)条件下，两柱的穿透曲线呈现出图 3(b)所示的情况，因此选择第一根层析柱80%穿透作为双柱连接模式上样的终点。随着保留时间减小(< 1 min)和蛋白浓度增加(> 2 mg·mL-1)，两柱穿透曲线开始呈现图 3(a)所示的情况，选择第二根层析柱1%穿透作为双柱连接模式上样的终点。
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表 1 介质连续流层析过程和批次层析的操作参数 Table 1 Operation parameters of continuous chromatography with UniMab |
层析分离中保留时间是影响穿透曲线和吸附性能的重要因素，也是连续流层析的关键影响因素。本文考察了不同保留时间下(0.5~4 min)双柱连续流层析的分离性能，以产率、介质利用率和缓冲液消耗作为评判指标，并与批次层析进行比较，结果见图 6。
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图 6 连续流层析和批次层析在不同保留时间下的性能比较 Fig.6 Comparison of process performance between continuous and batch chromatography under different residence times ○ MabSelect SuRe_batch ● MabSelect SuRe_continuous △ UniMab_batch ▲ UniMab_continuous |
产率比较见图 6(a)。随着保留时间增加，两种介质、两种分离模式的产率都呈现先上升后下降的趋势，与文献报道[22, 25]相似。相比较而言，连续流层析的最高产率出现在较低的保留时间(1 min)。保留时间对产率的影响是双方面的，一方面，保留时间增加，穿透曲线变陡，介质动态载量提高，产率有增大趋势；另一方面，流速减慢，造成操作时间增加，产率有减小趋势。如表 1所示，对于批次层析，保留时间从0.5 min提高至2 min时，载量提高更加显著，产率呈现上升趋势；当保留时间继续增加至4 min，动态载量虽然有所提高，但过程时间却成倍增加，导致产率下降，因此2 min处出现产率最大值。对于连续流层析，随着保留时间由0.5 min增加至1 min，上样量显著提高，产率上升；再进一步增大至4 min，上样量仅仅从52.3 mL提高至58.2 mL，而每个循环的时间却由107 min增至266 min，因此产率出现大幅度下降。比较发现，两种分离模式的产率随保留时间变化曲线存在一个相交点，大约在2 min处，低于这个保留时间，连续流层析拥有更高的产率；高于该保留时间，批次层析拥有更高的产率。这主要是由于在低保留时间下，双柱串联上样使得介质载量显著提高，产率提升明显；当保留时间较大时，连续流层析的上样量提升有限，而循环时间却明显提高，造成产率略低于批次层析过程。相比之下，双柱连续流层析在低保留时间下具有明显优势，可以实现高流速操作，显著提升产率。
介质利用率的比较见图 6(b)。随保留时间增加，批次层析和连续流层析的介质利用率都不断提高，不过连续流层析的介质利用率远远高于批次层析过程。主要原因是随着保留时间的增加，穿透曲线更陡，介质的动态载量提高。在实际应用过程中，由于蛋白A亲和介质价格昂贵，通常要求介质利用率高于50%，对于批次层析就需要保留时间达到4 min以上，而此时的产率较低(见图 6(a))。对于连续流层析，在较低的保留时间(1 min)下介质利用率就能达到60%以上，且具有较高的产率。比较两种介质可以发现，在相同保留时间下，UniMab介质具有更高的介质利用率。
缓冲液消耗的比较见图 6(c)。可以发现，连续流层析的缓冲液消耗远远低于批次层析过程。保留时间1 min时，连续流层析过程的缓冲液消耗仅仅为批次层析的20%左右；随着保留时间增加，该比例会提高至40%~60%，与文献报道[22, 25]相一致。
整体而言，随着保留时间增加，两种分离模式的产率先增加后减小，介质利用率持续增加，缓冲液消耗持续减少，在低保留时间条件下，双柱连续流层析拥有更优越的分离性能，在保留时间1 min时拥有最高的产率。
4.3.2 蛋白浓度影响上样蛋白浓度是影响吸附过程的另一重要因素。选择保留时间1 min，考察不同IgG浓度(0.5~10 mg·mL-1)对两种分离模式的影响，结果见图 7。
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图 7 连续流层析和批次层析在不同蛋白浓度下的性能比较 Fig.7 Comparison of process performance between continuous and batch chromatography under different protein concentrations ○ MabSelect SuRe_batch ● MabSelect SuRe_continuous △ UniMab_batch ▲ UniMab_continuous |
产率比较见图 7(a)。随着蛋白浓度升高，两种介质在两种不同层析模式下的产率都不断提高，与文献报道[22, 25]相符。由于蛋白浓度上升，上样体积减少，上样时间减少，产率提高。如表 1所示，IgG浓度为0.5 mg·mL-1时，连续流层析每个循环的上样量为204.8 mL，完成一个循环的时间为247 min；当浓度提高至10 mg·mL-1时，每个循环的上样量降为12.8 mL，循环时间降为73.6 min，虽然每个循环得到的蛋白量差不多，但是操作时间却降为原来的1/3左右，因此产率提高。两种模式比较发现，连续流层析的产率优于批次层析过程，特别是对于高蛋白浓度(> 2 mg·mL-1)。比较两种介质，可以发现UniMab介质优于MabSelect SuRe介质，这是由于UniMab介质具有较高的动态载量，特别是在高流速、低保留时间条件下。
介质利用率的比较见图 7(b)。可以发现，不同蛋白浓度条件下，双柱连续流层析的介质利用率都远远高于批次层析过程，这主要是由于连续流层析中，每根层析柱的吸附量都远远大于批次层析过程。此外，还发现蛋白浓度对介质利用率影响较小，这是因为在相同保留时间的条件下，不同蛋白浓度的穿透曲线较为接近。
缓冲液消耗比较见图 7(c)，连续流层析的缓冲液消耗远低于批次层析过程。无论连续流层析还是批次层析，随蛋白浓度增加，缓冲液消耗的变化幅度均不大，这主要是因为不同蛋白浓度条件下的穿透曲线较为接近，每个批次或循环得到的产品接近，导致缓冲液消耗变化不大。
整体而言，随着蛋白浓度增大，产率持续增大，介质利用率和缓冲液消耗变化幅度均较小。对于高蛋白浓度(> 2 mg·mL-1)，连续流层析的分离性能明显高于批次层析过程。
4.3.3 细胞培养液中捕获单抗CHO细胞培养液中单抗浓度为2.8 mg·mL-1、纯度约为26.7%。依据前文，在上样IgG浓度为2 mg·mL-1、保留时间1 min时，双柱连续流层析拥有最佳的分离性能，产率高、介质利用率高、缓冲液消耗少，因此，实际料液的单抗分离中选择保留时间1 min。图 8是两种介质的穿透曲线比较，与前文的hIgG穿透实验类似，UniMab介质的动态载量高于MabSelect SuRe介质，二者的1%穿透载量分别为21和12.6 mg·mL-1，10%穿透载量分别为35和22.4 mg·mL-1。
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图 8 两种层析介质的单抗料液穿透曲线 Fig.8 Breakthrough curves of mAb from CHO cell culture broth studied with the two resins |
分离结果列于表 2，单抗纯度均大于97%。可以发现，双柱连续流层析捕获抗体的效果良好，单抗纯度、收率、聚集体含量、HCP含量、HCP对数减少值(log reduction values, LVR)等指标均与批次层析过程类似，产率和介质利用率显著提高，缓冲液消耗明显下降。对于MabSelect SuRe介质和UniMab介质，产率分别提高了67%和37%，介质利用率从20%~ 30%提高到70%~80%, ，缓冲液消耗下降为常规批次层析过程的1/5~1/4。
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表 2 两种层析介质的分离效果 Table 2 Process performance of two different resins |
基于上述实验结果，进行了2000 L单抗料液的模拟计算。连续流层析选用1 min保留时间，批次层析采用4 min保留时间，料液处理时间设定为36 h。根据前文中每个批次处理时间或连续流层析每个循环所需时间，得到36 h内的批次或循环次数，然后计算每个批次或循环处理量，最后得到所需的介质使用量，结果如表 3所示。可以看出，双柱连续流层析具有更好的分离性能，产率和介质利用率显著提高，缓冲液消耗明显下降。对于MabSelect SuRe介质和UniMab介质，产率分别提高了46%和39%，介质利用率分别提高了21%和28%，缓冲液消耗分别下降了45%和36%。综合而言，采用双柱连续流层析，一方面拥有更高的产率和更高的介质利用率，可以使用更小的层析柱，相同时间内蛋白A亲和介质可进行更多的生产循环，提高了介质的使用寿命，介质用量比常规批次层析减少30%~40%，显著降低了蛋白A介质成本。此外，使用更小的层析柱、匹配更小的层析设备和厂房空间，则进一步降低了生产成本。
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表 3 单抗料液分离的模拟计算 Table 3 Simulation results of mAb capture from cell culture broth using batch and continuous processes |
针对双柱连续流层析，以两种蛋白A亲和介质MabSelect SuRe和UniMab为典型介质，比较分析了双柱连续流层析和常规批次层析过程的差异，考察了保留时间和蛋白浓度的影响，实现了细胞培养液中单抗的分离。通过比较不同保留时间和IgG浓度下的穿透曲线，得到了双柱连续流层析的合适操作参数，分析了保留时间和蛋白浓度对产率、介质利用率和缓冲液消耗的影响。结果表明，在载量和连续流层析分离性能方面，UniMab介质整体优于MabSelect SuRe介质。随保留时间增加，产率呈现先增加后减小的趋势，介质利用率持续增加，缓冲液消耗持续减少；在低保留时间条件下，双柱连续流层析拥有更优越的分离性能，适合于高流速操作；随着蛋白浓度增大，产率显著增大，介质利用率和缓冲液消耗变化不大。对于从细胞培养液中分离单抗，单抗纯度达到97%以上、收率87%以上、聚集体含量低于2%、HCP含量低于300 ppm，产率和介质利用率显著提高，缓冲液消耗下降，显示出良好的应用前景。
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