1 前言

胆酸(cholic acid，CA)是存在于人和脊椎动物胆汁中的一种甾类物质^[1]，分子式为C₂₄H₄₀O₅，结构式如图 1所示。CA属于初级胆汁酸，是众多胆汁酸中最容易提取的一种胆汁酸，现代中药制剂中多将其提取入药如复方牛黄散、消痔灵胶囊中，用于治疗热病神昏、中风痰迷、咽喉肿痛、口舌生疮等症状^[2-3]。同时胆酸也是熊去氧胆酸、石胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸等名贵药物的底物^[4-8]，为解决药物学上对牛黄、熊胆、蛇胆等药物的需求和来源紧缺的矛盾^[9-10]，因此，研究开发胆酸具有重要意义。

目前高纯的胆酸在国内外产量总体不足，但需求旺盛。结晶是物质提纯的主要方法之一，广泛应用于工业生产具有明确的理化性质的各种制品中^[11-12]。尤其在制药行业，结晶是最为重要的纯化步骤。溶解度和热力学性质则是决定结晶方法和工艺不可或缺的基础数据^[13-16]，此外，溶解度和热力学性质还可为晶体形貌的优化、新晶型的研发提供参考^[17-18]。根据文献调研，本研究选取工业提取纯化胆酸最常用的乙醇、乙酸乙酯、醋酸等溶剂，研究胆酸在不同溶剂中的溶解度，并计算其各自的表观热力学性质，可为胆酸提纯的生产工艺开发提供一定的理论基础。

2 实验材料和方法 2.1 实验原料及试剂

胆酸(98%，上海阿位丁生化科技股份有限公司)；甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；冰醋酸(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；正丙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)。以上原料试剂均已通过高效液相色谱(LP-20A，日本岛津公司)验证。

2.2 胆酸的结构表征及熔点测定

胆酸的晶型及结构特征由X射线衍射仪(D/max-2550X，日本理学株式会社)测定。测试条件：扫描范围为2°~50°，扫描度数0.02°，扫描速度为8(°)⋅min⁻¹。胆酸的熔点和融化焓由差示扫描量热仪(Q20，美国TA Instruments公司)测定，温度测试范围为20~300 ℃，控制升温速率为10 ℃⋅min⁻¹，N₂保护。

2.3 溶解度测量实验装置和方法

采用重量法^[19]测定胆酸在甲醇、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸和正丙醇中的溶解度，其实验装置如图 2所示。该装置由超级恒温槽(THCD-2010，宁波天恒仪器厂)、磁力搅拌器(DF-101S，巩义市予华仪器有限公司)和一个带夹套的结晶器组成。环境温度由超级恒温槽循环水控制，恒温精度为±0.01 K。实验温度以水银温度计为准，测温精度为±0.1 K。用磁力搅拌器使固液两相均匀混合，加快胆酸在溶剂中的溶解。

首先将过量的胆酸和溶剂混合加入玻璃瓶中，在设定的温度下搅拌5 h以上。达到溶解平衡后，停止搅拌使颗粒沉淀。待沉降完全后，取上层清液，使用注射器搭配孔径为0.22 μm的有机系针头过滤器过滤到预先称重的小瓶(质量为m₁)中称重，称其质量为m₂，然后将其放于烘箱中蒸发溶剂，溶剂完全蒸发后质量为m₃，称量精度均为±0.000 1 g。则m₃−m₁为溶质质量，m₂−m₃为溶剂质量。每组实验重复上述操作3次，取算术平均值作为最终的实验结果。

胆酸的摩尔溶解度计算公式为

$ x = \frac{{{m_{\rm{s}}}/{M_{\rm{s}}}}}{{{m_{\rm{s}}}/{M_{\rm{s}}} + {m_i}/{M_i}}} $

(1)

3 实验结果与讨论 3.1 胆酸的结构表征及熔点测定分析

图 3为胆酸的X射线粉末衍射(PXRD)结果，其衍射角2θ为7.47°、10.37°、11.87°、12.92°、14.86°、18.33°、19.65°、21.81°的特征峰明显，与Material studio模拟出来的曲线的特征峰一一相对应。图 4为胆酸的DSC曲线，吸热峰前斜率最大点的切线与前基线的延长线的交点为CA的熔点^[20]，其熔点T_m为473.76 K，对其吸热峰积分得熔化焓Δ_fusH为97.73 J⋅g⁻¹。

3.2 溶解度测定实验装置的可靠性验证

氯化钠在水中的溶解度已有报道，因此，以氯化钠在水中的溶解度为标准，对溶解度测定装置和方法的可靠性进行验证。采用重量法测定氯化钠在水中的溶解度，并与文献值^[21]比较，结果如表 1所示。从表 1可以看出，氯化钠溶解度实验值w_exp与文献参考值w_ref符合良好，说明实验装置和方法可靠，可用于测定胆酸在溶剂中的溶解度。

3.3 胆酸溶解度数据及关联

由于冰醋酸冰点为16.2 ℃，所以测定了其在20~55 ℃的溶解度，其余4种溶剂均为0~55 ℃下测定的溶解度，具体测定数据如图 5所示。实验结果表明，胆酸在5种溶剂中的溶解度均随温度升高而增大，且对温度变化敏感；在相同温度下，胆酸在不同溶剂中的溶解度大小依次为：冰醋酸 > 甲醇 > 乙醇 > 正丙醇 > 乙酸乙酯，其规律与溶剂极性规律相同，符合“相似相溶”原理。

采用Modified Apelblat模型^[22](2)、λh模型^[23-24](3)、二次多项式模型^[25](4)及三参数van′t Hoff模型^[26](5)对CA在不同溶剂中的溶解度进行关联拟合。

$ \ln x = a + \frac{b}{T} + c\ln T $

(2)

$ {\ln _{}}\left( {1 + \lambda \frac{{1 - x}}{x}} \right) = \lambda h\left( {\frac{1}{T} - \frac{1}{{{T_{\rm{m}}}}}} \right) $

(3)

$ x = {A_1} + {B_1}T + {C_1}{T^2} $

(4)

$ \ln x = {A_2} + \frac{{{B_2}}}{T} + \frac{{{C_2}}}{{{T^2}}} $

(5)

采用RD、ARD和RMSD对热力学模型拟合结果进行分析^[27]，考察所选模型的适用性和准确性，计算如式(6)~(8)所示。

$ {\rm{RD}} = \frac{{{x_{i, {\rm{exp}}}} - {x_{i, {\rm{cal}}}}}}{{{x_{i, {\rm{exp}}}}}} $

(6)

$ {\rm{ARD}} = \frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {\left| {\frac{{{x_{i, {\rm{exp}}}} - {x_{i, {\rm{cal}}}}}}{{{x_{i, {\rm{exp}}}}}}} \right|} $

(7)

$ {\rm{RMSD}} = {\left[ {\frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {{{\left( {{x_{i, {\rm{exp}}}} - {x_{i, {\rm{cal}}}}} \right)}^2}} } \right]^{\frac{1}{2}}} $

(8)

RD、ARD和RMSD值越小，说明拟合值与实验值的偏差越小，拟合效果越好；反之，RD、ARD和RMSD值越大，拟合效果越差^[28]。实验值与拟合值之间的偏差(RD、ARD和RMSD)见表 2。

从表 2可以看出，采用Modified Apelblat模型、λh模型、二次多项式模型及三参数van′t Hoff模型均能很好地关联胆酸在5种有机溶剂中的溶解度数据，其模型方程均可预测胆酸在所测温度范围内不同溶剂中的溶解度，模型拟合参数见表 3。对比3种模型的关联结果，二次多项式模型的拟合效果略优于Modified Apelblat模型、λh模型和三参数van′t Hoff模型。

3.4 溶解热力学分析

在目前的研究中，与van't Hoff方程相比，修正的van't Hoff方程^[29]更适合计算溶质溶解过程中的热力学参数，而且当温度改变不大时，溶解焓Δ_solH和溶解熵Δ_solS等热力学参数可以看作常数，其表达式如下：

$ {\Delta _{{\rm{sol}}}}H = - R \times \frac{{\partial \ln x}}{{\partial \left( {\frac{1}{T} - \frac{1}{{{T_{\rm{m}}}}}} \right)}} $

(9)

$ {T_{{\rm{hm}}}} = \frac{N}{{\sum\limits_{i = 1}^N {\frac{1}{T}} }} $

(10)

根据实验的溶解度数据，以T⁻¹−T_hm⁻¹为横坐标，ln x为纵坐标作图，进行线性拟合，结果见图 6。其斜率为k，截距为d，其拟合参数见表 4。其Δ_solH、Δ_solS和Δ_solG可分别用下式计算。

$ {\Delta _{{\rm{sol}}}}H = - R \times k $

(11)

$ {\Delta _{{\rm{sol}}}}G = - R \times {T_{{\rm{hm}}}} \times d $

(12)

$ {\Delta _{{\rm{sol}}}}S = \frac{{{\Delta _{{\rm{sol}}}}H - {\Delta _{{\rm{sol}}}}G}}{{{T_{{\rm{hm}}}}}} $

(13)

为了比较Δ_solH和Δ_solS对溶解过程相对贡献的大小，这里引入2个热力学参数焓相对贡献ζ_H和熵相对贡献ζ_TS^[30]，计算式如下：

$ {\zeta _{\rm{H}}} = \frac{{\left| {{\Delta _{{\rm{sol}}}}H} \right|}}{{\left| {{\Delta _{{\rm{sol}}}}H} \right| + \left| {T{}_{{\rm{hm}}}\Delta {}_{{\rm{sol}}}S} \right|}} $

(14)

$ {\zeta _{{\rm{TS}}}} = \frac{{\left| {{T_{{\text{hm}}}}{\Delta _{{\rm{sol}}}}S} \right|}}{{\left| {{\Delta _{{\rm{sol}}}}H} \right| + \left| {{T_{{\rm{hm}}}}{\Delta _{{\rm{sol}}}}S} \right|}} $

(15)

计算的表观热力学性质Δ_solH、Δ_solS、Δ_solG、ζ_H和ζ_TS见表 5。

由表 5可知，胆酸在甲醇、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸和正丙醇中的Δ_solH、Δ_solS和Δ_solG均为正值，说明胆酸在所选的溶剂中的溶解均为非自发、不可逆的吸热过程。其中，冰醋酸的溶解焓变最大，可能是由于冰醋酸的溶解度最大，需要吸收更多的能量来完成溶解过程，而在甲醇、乙醇、乙酸乙酯和正丙醇中，其Δ_solH从大到小分别为乙酸乙酯 > 正丙醇 > 乙醇 > 甲醇，与其溶解度的规律相反；Δ_solG从大到小分别为乙酸乙酯 > 正丙醇 > 乙醇 > 甲醇 > 冰醋酸，也与其溶解度规律相反；Δ_solS均为正值，说明胆酸与溶剂分子混合打乱了溶剂分子之间的混合，所以体系混乱度增加，符合“熵增定律”。另外，ζ_H和ζ_TS分别在0.573 1~0.836 1和0.163 9~0.426 9，即ζ_H最小值为0.573 1，ζ_TS最大值为0.426 9，说明胆酸在所选溶剂溶解过程中，Δ_solH对Δ_solG的贡献大于Δ_solS。

4 结论

(1) 常压下，胆酸在所选择的5种有机溶剂中的溶解度均随温度升高而升高，在相同的温度下，胆酸在各个溶剂中的溶解度大小顺序为：冰醋酸 > 甲醇 > 乙醇 > 正丙醇 > 乙酸乙酯。

(2) 采用Modified Apelblat模型、λh模型、二次多项式模型及三参数van′t Hoff模型拟合胆酸在不同溶剂中的溶解度数据，结果表明4种模型均能取得较好的关联结果。对比4种模型的关联结果，二次多项式模型的拟合效果略优于Modified Apelblat模型、λh模型、三参数van′t Hoff模型。

(3) 采用修正的van′t Hoff方程计算了胆酸在5种有机溶剂中的溶解焓变Δ_solH、溶解熵变Δ_solS和溶解吉布斯自由能变Δ_solG，其值均大于0，表明胆酸在5种有机溶剂中的溶解过程均为吸热、熵增的非自发过程。计算了胆酸在各个溶剂中的焓相对贡献ζ_H和熵相对贡献ζ_TS，结果表明胆酸在所选的溶剂的溶解过程中，溶解焓变Δ_solH对溶解吉布斯能变Δ_solG的贡献大于溶解熵变Δ_solS。

符号说明：

A₁, B₁, C₁ —二次多项式模型参数       N —样本数量

A₂, B₂, C₂ —三参数van′t Hoff模型     R —气体常数，R=8.314 J⋅mol⁻¹⋅K⁻¹

a, b, c — Modified Apelblat模型参数    R² —拟合优度

ARD —平均相对偏差              RD —相对偏差

d —截距                   RMSD —均方根偏差

Δ_solG —溶解吉布斯自由能变，kJ⋅mol⁻¹     Δ_solS —溶解熵变，J⋅mol⁻¹⋅K⁻¹

h, λ — λh模型参数             T —实验温度, K

Δ_fusH —熔化焓，kJ⋅mol⁻¹           T_hm —调和平均温度，K

Δ_solH —溶解焓变，kJ⋅mol⁻¹          T_m —熔点，K

k —斜率                   w_exp —氯化钠溶解度实验值

M_i —溶剂的摩尔质量，g⋅mol⁻¹         w_ref —氯化钠溶解度文献值

M_s —溶质的摩尔质量，g⋅mol⁻¹         x —摩尔溶解度

m₁ —空瓶的质量，g              x_{i, cal} —溶解度拟合值

m₂ —空瓶加溶液的质量，g           x_{i, exp} —溶解度实验值

m₃ —空瓶加溶质的质量，g           2θ —衍射角，(°)

m_i —溶剂的质量，g              ζ_H —焓相对贡献

m_s —溶质的质量，g              ζ_TS —熵相对贡献