1 前言

生物基聚合物具有可持续性和环境友好的优点。预计到2030年，生物基聚合物将占全球化学品市场份额的25%，是当前生物、化学、药学及能源等交叉领域的研究热点^[1~5]。聚乳酸是一种具有优良生物可降解性和生物相容性的重要生物基聚合物，其单体乳酸主要经生物发酵制备，乳酸发酵所需底物来源丰富且可再生。然而，聚乳酸材料固有的坚硬、易脆断、疏水性较弱、热稳定性较差等特点，在一定程度上限制了其在化工和材料等关键工业领域的大量应用。聚苯乳酸是近年来新兴的生物基聚合物材料，与聚乳酸相比具有更强的热稳定性、机械性能和柔韧性，此外还具有优异的紫外线吸收能力，因此，引起了国内外学者的重视^[6]。

聚苯乳酸通常由苯乳酸(PLA)单体通过缩聚反应而得，苯乳酸分子结构含有苯基基团，其理化性能与乳酸不同，因此，聚苯乳酸和聚乳酸在稳定性和机械性能方面也存在明显差异。苯乳酸不仅是合成聚苯乳酸的重要单体，其合成和分离是影响聚苯乳酸工业化的关键；而且苯乳酸也是天然的抑菌剂，具有广谱抑菌性，理化性质稳定，水溶性好，天然存在于蜂蜜及中草药等物质中；另外，苯乳酸还是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞药物的关键前体。可见，苯乳酸在食品工业、医药、功能材料和化工等许多领域有重要应用前景^[7~10]。国内外学者先后对苯乳酸的抑菌性能、生物合成法、代谢途径及分离方法进行了一些总结^[11~13]，但有关苯乳酸的化学合成法、酶法合成及新型分离方法方面涉及较少，本文从以上几方面对国内外最新的研究进展进行综述，为聚苯乳酸及其单体的制备及工业化应用打下基础。

2 聚苯乳酸的研究现状

芳香族聚合物通常具有优异的热稳定性和出色的延展性能，聚苯乳酸除了具有以上特征外，还能吸收近紫外线和抵抗化学腐蚀等。近几年聚苯乳酸的合成已有报道，多数以合成乳酸和苯乳酸的共聚物材料为目标。

早期合成聚苯乳酸时常通过α-羟基酸直接缩聚而成，但所得产物分子量较低^[14]。Simmons等^[15]于2001年提出强疏水性苯乳酸高聚物的制备新方法，该方法首先利用液相缩合和热裂解苯乳酸低聚物两种方法制备二聚体，然后通过开环聚合反应制备出聚苯乳酸。作者同时指出聚苯乳酸存在显著的降解能力，它可以在55℃，pH 7.4环境中降解，且当温度大于300℃时聚苯乳酸可完全降解为单体并回收。Tsuji等^[16]以L-苯乳酸为原料并在对甲苯磺酸(催化剂)作用下直接进行缩聚反应，首先在温度130℃、压力101.3 kPa的氮气环境中反应5 h，随后降压为2.4 kPa继续反应24 h，得到分子量为67, 000 g·mol^-1的聚苯乳酸。Nguyen等^[6]对其合成方法进行改良，应用多种路易斯酸催化进行缩聚反应，得到理化性质更优良且平均分子量大于100, 000 g·mol^-1的聚苯乳酸。

研究者们^[17~20]通过差式扫描量热法、热重分析法以及旋光法对聚合物的物理性能进行了详细的表征，发现聚苯乳酸没有熔融峰，但是有典型的玻璃化转变曲线峰值，温度范围与聚乳酸接近，分析其原因可能是聚苯乳酸中存在大量的苯基，虽然会妨碍主链旋转，但同时形成的一个链间隙会削弱高分子链间的相互作用，导致上述现象发生；与聚乳酸性能相比，聚苯乳酸在苯基作用下，旋光度明显降低，且热降解的活化能随着苯乳酸共聚单体含量的增加而增大。

从现有研究来看，聚苯乳酸的制备方法相对容易实现，这为聚苯乳酸的工业化奠定了好的基础。但是，如何获取大量光学纯度的苯乳酸单体，是目前制备聚苯乳酸材料的研究重点。

3 苯乳酸的化学合成法

苯乳酸的化学合成法大致可以分为以下几种：锌汞齐还原法、苯丙酮酸催化氢化法、S_N2反应及不对称环氧化合成法^[21~25]。合成路线如图 1所示。

锌汞齐还原法是以苯甲醛为原料，与乙酰甘氨酸先形成吖内酯、再经过酸裂解、苯丙酮酸生成以及Clemmensen还原等4个步骤而成。李光兴等^[22]以Raney-Ni为催化剂将苯丙酮酸通过催化氢化反应，得到苯乳酸的白色结晶物，该合成方法下苯乳酸的产率很高，收率和转化率均令人满意。Draanen等^[23]在低温条件下，L-苯丙氨酸经过快速的分子内S_N2反应形成不稳定的脂族重氮盐，得到了α-内酯，在室温下与溶剂水发生反应，再经过一个缓慢的分子内S_N2反应，水解内酯得到最终产物L-苯乳酸。由于苯乳酸是一类具有光学活性的手性物质，故其含有两种对映异构体。Harada^[24]通过Darzen反应将获得的反式-β-苯基缩水甘油酸酯拆分，从而得到具有光学活性的苯乳酸。周小鸣等^[25]将E-肉桂醇在天然和非天然的酒石酸二异丙酯作用下经过Sharpless不对称环氧化反应，得到光学纯度均为92%的光学异构的苯基环氧醇，进一步在碳酸氢钠存在下利用催化剂RuCl₃-NaIO₄将苯基环氧醇氧化得到环氧酸，经过氨处理后用钯-碳催化氢化来获得苯乳酸。

4 苯乳酸的生物合成法

化学合成法制备苯乳酸成本较低，但由于这些合成法条件苛刻、副产物较多，且一般均需要使用毒性较大的溶剂，环境污染问题比较突出，限制了其规模化工业应用。近几年，国内外学者对苯乳酸的合成研究已逐渐转向生物合成法。

4.1 微生物生长代谢生成苯乳酸

苯乳酸可以由多种微生物代谢合成，白地霉菌、丙酸杆菌、芽孢杆菌、光养细菌以及乳酸菌的代谢产物中均含有苯乳酸，并且天然苯乳酸大多数是由乳酸菌分泌产生，作为乳酸菌代谢过程中的副产物分泌到细胞外。

有关微生物发酵生成苯乳酸的研究，Kamata等^[26]早在1986年就有相关报道，并提出用乳糖发酵短乳杆菌时可以得到R-3-苯基乳酸。Lavermicocca等^[27]在植物乳杆菌21B菌株发酵液中检测到了苯乳酸，这是乳酸菌产苯乳酸的首次报道。随后研究表明苯乳酸可以由多种乳酸菌属的乳酸菌产生。虽然各种乳酸菌的代谢能力各异，但其代谢物中苯乳酸含量均相对偏低(< 1g·L^-1)，如需利用这些菌株发酵来产生苯乳酸，必须进行发酵条件优化。有关部分乳酸菌代谢生成苯乳酸的研究汇总见表 1。Thierry等^[35]在研究由费氏丙酸杆菌代谢生成芝士香味化合物时，提出苯丙氨酸在羟基酸脱氢酶作用下还原为苯乳酸，同时苯丙氨酸通过非酶降解为苯乙酸和苯甲醛，苯甲醛再进一步氧化生成苯甲酸。2012年Prasuna等^[36]利用L-苯丙酮酸作为唯一的氮源发酵光养细菌JA2，研究结果表明其具备生成L-苯乳酸的能力。

4.2 全细胞催化合成苯乳酸

全细胞催化法，即以微生物整体细胞作为反应催化剂，加入底物如苯丙酮酸或者苯丙氨酸，菌体在一定条件下，经过一段时间催化合成苯乳酸。该方法转化效率高，产物易分离纯化，成本低，有工业化应用前景。

2007年，Li等^[29]从中国传统泡菜中分离出一株自身代谢生成苯乳酸产量仅为0.091 g·L^-1的植物乳杆菌SK007 (表 1)，并研究了菌株利用不同底物转化合成苯乳酸的过程，结果表明，当苯丙酮酸替代苯丙氨酸作为底物时，其苯乳酸的产量显著提高。由于底物苯丙酮酸的溶解性差，所以可以适当提高温度来促进溶解。从另一方面来说，适当升高反应温度会促进催化能力的提升。Zheng等^[37]筛选出一株嗜热菌---凝结芽孢杆菌，该菌株具有良好的温度耐受性，升高反应温度后，随着底物溶解速率的增加，使得催化反应得以更快地进行。他们还通过在全细胞催化反应中多次补充底物葡萄糖、苯丙酮酸及NaOH，以维持使底物供给充足及反应环境pH稳定不变，最终得到37.3 g·L^-1的苯乳酸。

本课题组^{[30, 38]}从泡菜中筛选出一株性能优良的干酪乳杆菌B3，具有催化苯丙酮酸合成苯乳酸的能力。朱银龙等^[30]首先优化了该菌株的催化条件，将干酪乳杆菌B3的静息细胞在-20℃下冷冻6 h进行透性化处理后，以苯丙酮酸为底物转化4 h，得到5.3 g·L^-1的苯乳酸。随后韩朝飞等^[38]以8 g·L^-1苯丙酮酸为底物，针对干酪乳杆菌B3在静置、搅拌及通气搅拌3种不同控氧条件下的催化情况进行了研究，结果表明，所得菌体转化合成苯乳酸的摩尔转化率分别为35.9%、62.7%和67.2%，说明适度的搅拌促进了发酵过程的底物和产物传质，有利于发酵合成苯乳酸；但充足的供氧影响了转化合成的酶系，不利于苯乳酸的转化合成。

4.3 酶法合成苯乳酸

基因工程和蛋白质工程的发展使得酶学在生物技术领域得到广泛的应用。与化学催化相比，生物酶催化具有催化效率高、专一性强及酶活性可以调控等特点。苯乳酸的生物合成途径如图 2所示，苯丙氨酸经转氨作用生成苯丙酮酸，苯丙酮酸进一步还原成苯乳酸。故应用关键酶过表达于工程菌株中或直接进行催化反应是一条可行路线。

4.3.1 酶法催化苯丙氨酸合成苯乳酸

苯乳酸合成开始于苯丙氨酸的分解代谢，苯丙氨酸首先在具有广谱催化活性的芳香氨基转移酶作用下将氨基基团转移至合适的α-酮酸受体，α-酮酸受体进一步在谷氨酸脱氢酶作用下生成谷氨酸盐。其中谷氨酸脱氢酶的活性与细胞氧化还原状态相关，反应中可通过添加柠檬酸盐、果糖和葡萄糖等充当可供选择的电子受体，以此增加氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)⁺，促进苯乳酸的合成^[11]。Dallagnol等^[39]通过在复合培养基中添加生物合成前体苯丙氨酸和酪氨酸、中间产物谷氨酸盐和α-酮戊二酸以及电子受体柠檬酸盐来评估植物乳杆菌CRL778产抑菌物质的能力，研究表明苯丙氨酸会促进苯乳酸的合成，由于氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺含量的增加，柠檬酸能够同时促进苯乳酸和羟基苯乳酸的合成。这种促进效应以及谷氨酸脱氢酶的活性与α-酮戊二酸含量成正比，且与谷氨酸盐含量成反比。

4.3.2 酶法转化苯丙酮酸合成苯乳酸

从苯乳酸合成路线可以看出，苯丙酮酸是苯乳酸生物合成中最直接的前体，苯丙酮酸在脱氢酶的作用下还原为苯乳酸也是目前酶催化的研究热点。2011年Fujii等^[40]找到一株可以产苯乳酸的真菌荧光威克酵母TK1，并从中提取出苯丙酮酸还原酶，将纯化后的酶克隆并在大肠杆菌中表达，而后Fujita等^[17]利用真菌荧光威克酵母TK1定向合成芳香族聚合物，结果表明，在重组大肠杆菌发酵液中添加182 g·L^-1葡萄糖可以生产29.2 g·L^-1苯乳酸。Kawaguchi等^{[10, 41]}在Fujita研究基础上，将经稀酸处理过的高粱渣水解液作为转化苯乳酸的底物，比较分步糖化发酵和同步糖化发酵两种发酵工艺对苯乳酸产量的影响。相较于分步糖化发酵，处于葡萄糖限制条件下的同步糖化发酵能将苯乳酸产量提高4.8倍，同时能够减少抑制组分。

近年来利用基因工程菌催化苯乳酸的研究逐渐转向为共表达体系的构建^[42~45]，Yu等^[43]在2012年从戊糖片球菌ATCC 25745中克隆出D-乳酸脱氢酶并在大肠杆菌中表达，经过一系列纯化过程得到纯酶，D-乳酸脱氢酶在辅酶NADH的作用下，在pH值为5.5且温度为45℃时催化苯丙酮酸合成苯乳酸活性最高。但由于辅酶NADH价格昂贵，限制了其工业化发展，辅酶再生系统的建立解决了这一问题，如图 2所示。随后，Yu等^[44]将来自戊糖片球菌的D-乳酸脱氢酶和Ogataea parapolymorpha的甲酸脱氢酶组成双酶系进行反应，当两种酶浓度均为0.4 μM并按照1:1加入时，苯乳酸产量提高了约30倍，最终浓度达到0.91 g·L^-1。2017年，Zhu等^[45]提出L-苯乳酸的合成可以通过one-pot生物转化系统来实现，该系统由来自植物乳杆菌的L-乳酸脱氢酶与巨大芽胞杆菌的葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌内共表达，形成一个自氧化还原体系，使得通过工程菌株进行全细胞催化苯丙酮酸为苯乳酸具有立体选择性，且该过程具有可持续性。通过分批补料，L-苯乳酸的产量达到17.23 g·L^-1，产率高达0.86 g· L^-1·h^-1。

乳酸脱氢酶是苯丙酮酸合成苯乳酸的关键酶，近年来利用乳酸脱氢酶转化苯丙酮酸合成苯乳酸呈现可见式增长，部分文献如表 2所示。乳酸脱氢酶通常对丙酮酸盐有较高的活性和亲和力，但由于苯丙酮酸C3位置有较大的疏水取代基致使催化活性相对较差，造成苯乳酸产量较低。目前有研究通过修饰乳酸脱氢酶的基因可以改变它对底物的催化能力，从而增强对底物的选择性及提高酶的活性^[46~49]。Zhu等^[49]分别用亮氨酸(Y52L)、丙氨酸(Y52A)和缬氨酸(Y52V)替代戊糖乳杆菌中乳酸脱氢酶的52位酪氨酸，研究突变后的乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化活性。结果显示替换52位酪氨酸能显著提高对苯丙酮酸的亲和力和催化活力，D-乳酸脱氢酶(D-LDH)、Y52L乳酸脱氢酶(LDH^Y52L)、Y52A乳酸脱氢酶(LDH^Y52A)和Y52V乳酸脱氢酶(LDH^Y52V)对丙酮酸与苯丙酮酸的酶活比分别为0.34，7.25，4.5和80，其中LDH^Y52V苯乳酸的产量最高。优化反应条件之后，E. coli pET-28a-d-ldhY52V产量提高了28%，摩尔转化率提高了21%，产量达到15.6 g·L^-1。

由此可见，应用生物合成法制备苯乳酸是未来的主要发展趋势。利用基因工程手段对菌株进行改造继而用于苯乳酸的合成，其优势在于效率远远高于野生菌株，但应注意的是工程菌株的制备过程较繁琐，质粒稳定性和生物安全性也有待考究。同时，应用苯乳酸生物合成中的关键酶系来直接进行反应，也是一个有较大潜力的研究方向，对关键酶的分离纯化仍可以进一步提高。

5 苯乳酸的分离纯化

生物合成法制备有机酸要实现其工业化，目标产物的分离提纯是不可忽视的，这一过程的收益与产物的纯度和收率密切相关，单位时间内获得更多高纯度的产物是分离提纯步骤的目标。

5.1 苯乳酸的常规纯化方法

微生物法制备苯乳酸是主要发展方向，但下游提取分离技术限制了微生物转化合成苯乳酸的工业化进程。

文献调研表明，目前针对苯乳酸分离的研究不多，且大部分技术处于实验室规模。倪正等^[12]对苯乳酸的分离进行了简要综述，归纳了对苯乳酸分离的常见手段有萃取、大孔树脂和毛细管手性电泳三种。这些分离手段能够有效地从含有微生物细胞的发酵液中分离纯化苯乳酸且苯乳酸回收率较高。但是，应用萃取法和大孔树脂法提取苯乳酸的工序复杂繁琐，包括过滤或离心、高温活性炭吸附、离子交换树脂吸附、洗脱、萃取、浓缩、结晶等步骤，整个分离纯化的过程往往需耗费几天到数个星期的时间，在处理量较少时分离效果较好，但分离产物中含有一定量的杂质，很难达到制备聚苯乳酸的要求，关于这两种方法的部分文献总结见表 3。毛细管电泳法常用于苯乳酸的手性拆分，利用手性选择剂与苯乳酸镜像异构体形成不同稳定的配合体，从而达到手性分离的目的。其分离效果显著，但仅适用于微量检测分离，无法进行规模化生产。文献报道应用毛细管电泳法拆分苯乳酸的分离条件及结果归纳见表 4。

5.2 苯乳酸的柱层析分离法

由以上众多分离手段来看，从发酵液中分离纯化苯乳酸是可行的。总的来说，常规纯化方法通常需要一系列复杂的预处理过程，存在处理量较小，或工序繁琐且反应条件苛刻等特点，且主要针对的是小规模的实验室研究，尚没有适于规模化应用的分离纯化方法。基于以上原因，要提高生物合成路线在经济上的竞争能力，亟需一种针对发酵液的高效简便的提纯技术。

柱层析是生物分离中应用最广泛的方法之一，层析介质是其关键。常规介质尚不适于直接处理含细胞碎片等杂质的原料液流体，如Thinh^[56]以301树脂作为介质从发酵液中成功分离出苯乳酸，具有工业放大的潜力，但其步骤繁琐，吸附容量及回收率仍不够理想。晶胶介质^[63]是近年来在生化分离领域新兴的一种层析介质，在水溶液中具有良好的连通性、弹性和复原能力，由于其内有大量相互连通、尺寸在数十到数百微米的超大孔隙，允许具有一定黏度的复杂料液顺利通过，实现与扩张床可比拟的高流速层析过程，可简化发酵液中苯乳酸分离过程，实现规模化应用。虽然应用晶胶介质分离苯乳酸的研究尚未有报道，但已有研究表明晶胶能从复杂料液中分离出其他多种生物分子^[64~66]。Yun等^[66]曾报道，应用具有叔胺基团的阴离子交换晶胶介质，一步法从酵母法发酵液中提纯三磷酸腺苷(ATP)，在层析过程中原料液可以顺利的通过晶胶柱而没有发生堵塞现象，经液相检测ATP纯度高达95%。这些报道为晶胶介质分离苯乳酸奠定了坚实的基础。应用晶胶介质分离苯乳酸还处于实验室研究阶段，分离过程迅速高效、没有使用毒性溶剂，但回收率较差。总的来看，苯乳酸在发酵液或转化液中的浓度不高，一些菌株在发酵过程中还常常形成了其它有机酸副产物，可以将晶胶基质通过原位接枝不同功能基团后来实现从原料液中直接分离苯乳酸，不断探索以达到工业化的要求。

6 总结与展望

对聚苯乳酸的研究现状、苯乳酸单体的化学合成、生物合成以及分离纯化方法进行了综述，总结了近年来国内外的研究进展。首先，聚苯乳酸通过苯乳酸单体在路易斯酸催化下直接缩聚合成，获取高纯度的苯乳酸是聚苯乳酸材料工业化的关键步骤；其次，对于苯乳酸单体的合成，生物法更具有可持续发展性。相对于基因工程菌的制备复杂性、质粒稳定性和生物安全性，用天然优良菌株合成苯乳酸是未来的研究方向；再次，对于这类复杂发酵过程，生物制备工业化急需解决的关键问题是高效而易行的分离技术，而常规纯化方法存在或处理量较小、或工序繁琐而损耗较大等特点，晶胶介质层析是一种新型生物分离技术，其分离步骤少，过程简单，有望用于苯乳酸的分离；另外，苯乳酸高产菌株筛选、关键酶、产物分离及聚苯乳酸的聚合新方法等，也是聚苯乳酸及单体研究领域的研究重点。