1 前言

没食子酸甲酯是没食子酸的甲酯衍生物，是一种活性多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、抗微生物、抗炎、抗糖基化等生物活性^[1-3]，在工业上可用作橡胶防老剂，也是常用抗肝炎药联苯双酯的重要中间体。没食子酸甲酯由没食子酸和甲醇在浓硫酸的催化作用下发生酯化反应来合成。在小试规模下，反应时间为6~8 h ^[4]；在工业生产规模下，反应时间长达12 h。

通常，反应速率和产物产率受多种因素影响，如催化剂的选择和用量、反应物质的量比、反应温度和反应时间等^[5]。在工业生产中一般将上述因素保持在预设范围内，但对于很多生产工艺而言，终点是可变的，需要被精确监控^[6]。在实际工业规模没食子酸甲酯化反应中，通常以固定且超长的反应时间来保证目标产物产量最大化，但反应时间过长会造成能源、人力等浪费，降低生产效率。因此，有必要实时监控没食子酸甲酯化反应，准确判断反应进程，保证生产效益最大化。

常用的反应监测方法包括滴定、高效液相色谱、薄层色谱、气相色谱等。这些检测方法，通常需要对样品进行复杂的前处理，且检测时间长，难以满足反应过程监测与控制要求。近年来，近红外光谱^[7-10]、拉曼光谱^{[1, 8, 11-14]}、核磁共振波谱^{[8, 15]}等过程分析技术逐渐应用于化学反应过程实时监测，及时获取反应动力学^{[1, 7, 9-10, 13, 15]}、形态变化^[12]、反应终点时间^{[7, 15]}、反应物和产物质量浓度^{[1, 8-9, 11, 15]}等信息。酯化反应过程中有水生成，逐渐由有机相体系转变为水体系。水分子是一个较差的拉曼散射体，使用拉曼光谱检测水体系中的有机官能团振动是较为方便的^[1]；近红外光谱则会受到水的强烈影响，在水体系中进行其他成分的鉴定和定量较为困难。另外，核磁共振波谱使用成本较高。同时，使用原位拉曼光谱对酯化反应进行在线监测已经有很多研究。Ampiah-Bonney等^[13]用拉曼光谱对乙酸乙酯合成过程进行了动力学研究；Elfanso等^[1]利用拉曼光谱监测在异辛烷中脂肪酶催化油酸与乙醇的酯化反应过程；Chen等^[12]利用拉曼特征峰面积比对对苯二甲酸和1, 3-丙二醇的酯化反应过程建立了一种用于确定清晰点的定性分析方法。

因此，本研究以没食子酸甲酯化反应过程为对象，基于在线拉曼光谱技术，建立该反应过程分析方法，增加对反应过程的了解，为实现工业生产在线监控提供依据。

2 实验部分 2.1 仪器与试剂

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器有限公司)；流量型蠕动泵(常州维西尔流体技术有限公司)，配有Norprene®Chemical蠕动泵软管(抗化学腐蚀性，保定兰格恒流泵有限公司)；石英流通池(光程1 cm，宜兴晶科光学仪器有限公司)；不锈钢支架(杭州天宝机电设备有限公司)；Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent科技有限公司)，配备在线脱气机、四元泵、标准型自动进样器、柱温箱和VWD检测器；i-Raman Plus便携式拉曼光谱仪(美国B & W Tek)，配备785 nm激光源(约300 mW)、电荷耦合器件检测器和BAC101工业级拉曼探头。

没食子酸(质量分数 > 99%，L2031358，阿拉丁)；没食子酸甲酯(质量分数 > 98%，A1810031，阿拉丁)；浓硫酸(质量分数为95%~98%，国药集团)；甲醇(色谱级，德国Merk公司)；超纯水由Milli-Q水纯化系统(美国Millipore公司)产生；磷酸(质量分数 > 85%，国药集团)。

2.2 方法 2.2.1 没食子酸甲酯化反应与实验装置

没食子酸甲酯化反应的化学反应方程式(图 1)为：

实验装置示意图如图 2所示。向四颈烧瓶中加入定量甲醇和没食子酸(按工业生产等比例缩小)，升温溶解后降至常温，在控温条件下滴加浓硫酸，升温至反应温度，回流6 h。

2.2.2 拉曼光谱采集

由于反应体系具有强酸性和腐蚀性，插入式探头容易被腐蚀，因此采用流通池结构实现光谱对反应体系的在线检测^[16]，即通过蠕动泵使烧瓶中的溶液泵出，溶液流经流通池，经探头检测后，流回烧瓶。探头与反应溶液之间用石英流通池隔开，探头由金属模块固定。其中，到达流通池前经过的管路长68 cm，按流速14 mL⋅min⁻¹计算测量时滞约88 s，与6 h的反应时间相比，可以忽略该时段内反应溶液的变化，因此满足在线监测要求。拉曼光谱采集参数为：光谱范围172.91~3 201.75 cm⁻¹，激光强度100%，积分时间20 s，平均次数3次，每张光谱采集间隔时间为0 s，每组实验可采集351张光谱。在不同反应温度下进行3组实验，共采集1 053张光谱。

2.2.3 参考值分析

使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法分析反应过程中没食子酸质量浓度。每组实验中，0~1 h每5 min取样一次，1~3 h每10 min取样一次，3~5 h每20 min取样一次，5~6 h每30 min取样一次，每次取样400 μL，冷却至常温后用水稀释125倍，得供试品溶液。每组实验33个样品，3组实验共99个样品。

色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.05%(体积分数)磷酸-水溶液，采用梯度洗脱程序：0~10 min，5% A~10% A；10~26 min，10% A~30% A；26~27 min，30% A~80% A；27~37 min，80% A~80% A。流速为1 mL⋅min⁻¹，进样量为5 μL，柱温为25 ℃，检测波长269 nm。按上述色谱条件进行方法学考察：没食子酸检测质量浓度在0.016 6~2.076 2 mg⋅mL⁻¹时，与峰面积相关系数r为0.999 86；精密度的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.20%；重复性的RSD为0.56%；没食子酸低、中、高质量浓度平均加样回收率为101.09%，RSD为0.81%；48 h内稳定性的RSD为0.73%。

2.2.4 校正模型建立

以甲醇为溶剂配制19个质量浓度为2.985 0~208.032 3 mg⋅mL⁻¹的没食子酸对照品溶液，流速设定为14.0 mL⋅min⁻¹，每个质量浓度的对照品溶液测定3张拉曼光谱，共计获得57张光谱。使用Unscrambler X 10.4软件对基线进行基线偏移和线性基线校正，以减少实验过程中仪器和环境造成的不可预测的变化；使用Savitzky-Golay平滑法进行平滑处理，多项式阶数设为3，窗口宽度设为13。以一元线性回归方法和偏最小二乘(partial least squares，PLS)回归算法建立没食子酸甲酯化反应过程中拉曼光谱与没食子酸浓度的定量校正模型。使用决定系数R²、校正均方根误差(RMSEC)和验证均方根误差(RMSEP)对模型进行评价^[16]。R²、RMSEC及RMSEP的定义如下：

$ {R^2} = \frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{{\hat y}_i}_{, {\rm{cal}}} - \bar y} \right)}^2}} }}{{{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {\left( {{y_i} - \bar y} \right)} }^2}}} $

$ {{\rm{RMSEC}}} = \sqrt {\frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{y_i} - {{\hat y}_i}_{, {\rm{cal}}}} \right)}^2}} }}{n}} $

$ {{\rm{RMSEP}}} = \sqrt {\frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{y_i} - {{\hat y}_i}_{, {\rm{pre}}}} \right)}^2}} }}{n}} $

式中：n为样本个数，y_i和$ \bar y $分别为第i个样本的参考值和全部样本参考值的平均值，${\hat y_{i, {\rm{cal}}}}$和${\hat y_{i, {\rm{pre}}}}$分别为校正集和预测集中第i个样本的预测值。

3 结果与讨论 3.1 光谱特征峰分析

将一定量的没食子酸和没食子酸甲酯粉末溶于甲醇中，测得的拉曼光谱如图 3所示。没食子酸的特征峰在702.7、792.6和957.5 cm⁻¹，没食子酸甲酯在747.9和916.3 cm⁻¹处有明显的特征峰。

3.2 校正模型的建立

使用Origin 2019b软件对拉曼位移分别为702.7、792.6和957.5 cm⁻¹这3个形态较好的没食子酸特征峰，以峰高为x，没食子酸质量浓度为y，进行线性回归，求得标准曲线，计算其R²和RMSEC，如表 1所示。结果表明，没食子酸的检测质量浓度在2.985 0~208.032 3 mg⋅mL⁻¹时，与特征峰相对强度表现出良好的线性关系，R²均大于0.999，且重复性良好，满足定量要求。

间隔选取7个对照品溶液分别在18.5和9.5 mL⋅min⁻¹流速下测定3次拉曼光谱，使用上述的线性回归模型进行预测，考察流速对光谱测量系统的性能影响。结果如表 2所示，RMSEP均小于3 mg⋅mL⁻¹。因此，流速对光谱测量系统的性能影响极小，在9.5~18.5 mL⋅min⁻¹的流速范围内可以忽略。

3.3 没食子酸甲酯化反应过程监测 3.3.1 反应过程的定量分析——线性回归模型

进行没食子酸甲酯化反应，流通池内溶液流速设定为14.0 mL⋅min⁻¹。以校正模型对没食子酸质量浓度进行预测。将预测值与HPLC分析得到的质量浓度值进行比较，评估模型性能如表 3所示。反应温度为65、70、75 ℃时，线性范围内分别有32、33、30个样品用于预测。

没食子酸甲酯位于747.9和916.3 cm⁻¹处的特征峰，对没食子酸位于792.6和957.5 cm⁻¹处的特征峰影响较大，因此预测结果不佳。没食子酸702.7 cm⁻¹处的特征峰受干扰较小，具有较好的预测能力，且在65~75 ℃，RMSEP均小于3.4 mg⋅mL⁻¹。

3.3.2 反应过程的定量分析——PLS模型

以3个特征峰波段进行PLS建模，结果如表 4所示。

不同波段建立的模型，R²均大于0.999 5，RMSEC均小于线性回归模型的RMSEC；在不同反应温度下RMSEP差别较大，模型预测性能不佳。一般来说，PLS模型使用范围较宽的波段进行建模，可以提取光谱中更多的隐藏信息，但在该反应中建模效果不佳。可能是由于本实验中使用没食子酸对照品溶液进行建模，PLS模型未掌握没食子酸甲酯相关信息。因此在没食子酸甲酯特征峰的干扰下，无法做出精准的预测。

综上所述，针对不同反应温度的没食子酸甲酯化反应，由没食子酸对照品溶液拉曼光谱建立的线性回归模型，相对于PLS模型，具有更好的预测性能。以拉曼位移为702.7 cm⁻¹处的特征峰高对65、70和75 ℃反应温度下没食子酸质量浓度进行预测(图 4)，预测结果与HPLC分析得到的变化趋势基本吻合，RMSEP分别为3.248 3、3.314 3和3.175 6 mg⋅mL⁻¹。

3.3.3 反应过程的定性分析

以反应温度为75 ℃下获得的预处理后的351张拉曼光谱图(局部)为例，说明反应物和产物特征峰随反应时间的变化情况(图 5)。没食子酸的特征峰随反应的进行，相对强度逐渐降低；没食子酸甲酯的特征峰则随反应的进行，相对强度逐渐升高，符合化学反应规律。

以拉曼光谱数为横轴，相对强度为纵轴，绘制不同反应温度下，拉曼位移702.7 cm⁻¹处没食子酸特征峰相对强度随时间变化的曲线图(图 6(a))。为了更直观地观察反应速率随时间的变化，使用Unscramber软件计算一阶导数并进行Savitzky-Golay平滑处理(图 6(b))，多项式阶设为2，窗口宽度设为13。反应初始阶段，反应温度为75 ℃时反应速度最快，70 ℃次之，65 ℃时反应速度最慢，因此温度越高，反应越快；反应中后期，温度越高，反应则越快达到平衡状态，反应温度为75和70 ℃时，较65 ℃更快趋近于反应的平衡状态。

4 结论

本研究采用在线拉曼光谱对没食子酸甲酯化反应过程进行监测。结果表明，特征峰高的变化趋势可用于反映反应进程。使用一系列质量浓度的没食子酸对照品溶液建立线性回归模型，与PLS模型相比，对没食子酸质量浓度有更好的预测能力。将该模型用于反应在线监测，可以达到实时获取反应浓度的目的。在本研究中，反应容器到流通池的管路长度和液体流速决定了响应时间，实际生产应用中，可定制耐强酸腐蚀的插入式探头避免这段滞后时间。对于更加复杂的反应，可能出现难以寻找特征峰或特征峰相互干扰严重的情况，灵活应用光谱预处理方法和多变量分析技术手段，可以提高光谱信息挖掘能力。