人血白蛋白(human serum albumin，HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质，临床上HSA主要用于治疗因失血、创伤、烧伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等恶性病变，在癌症和艾滋病人放化疗的辅助治疗中也有较大需求[1]。目前治疗用HSA只能通过健康人血浆分离得到，由于血浆来源有限，HSA供给十分紧张，且存在血源性病原体的潜在风险，采用基因工程技术生产重组人血白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)有助于解决相关问题。rHSA已在真菌、动物细胞和植物细胞等多种系统中成功表达[2-4]，但发酵液成分非常复杂，除培养基成分外，还含有宿主细胞分泌的蛋白、多肽、脂质、多聚糖和色素等代谢产物，以及宿主细胞破碎后释放的核酸等杂质，rHSA分离纯化难度大，目前尚未有注射级的rHSA产品上市[5]。此外，pH对HSA结构有较大影响，在pH为4.3~8.0时，HSA分子以生理条件下的N型结构存在[6-10]。当pH小于2.7时，HSA分子呈延展的E型结构；当pH为2.7~4.3时，HSA分子呈快速迁移的F型结构；当pH为8~10时，HSA分子无α螺旋结构，呈B型结构；当pH大于10时，HSA分子呈A型结构。因此，分离过程需控制合适pH，过酸或过碱均会造成HSA构象变化，影响生理活性。
阳离子交换层析常用于分离rHSA，如Goodey等[11]采用阳离子交换介质SP Sepharose FF从酿酒酵母发酵液中捕获rHSA，选择性较低，且离子交换介质耐盐性差，需要稀释料液使得电导率低于5.5 mS·cm-1。基于多种相互作用的混合模式层析，可以有效组合疏水和静电相互作用，提高分离选择性[12-15]。李梅彦等[16]采用混合模式介质CST-Ⅱ FF从毕赤酵母发酵液中分离rHSA，该介质具有较强的耐盐性，但是选择性不高，在吸附后需要使用高浓度的NaCl溶液冲洗，以去除色素、糖、核酸和宿主细胞蛋白等杂质。杨代常等[17]采用混合模式介质Capto MMC从水稻种子提取物中分离rHSA，吸附后用浓度为1 mol·L-1的NaCl溶液冲洗，以去除吸附的杂质。Chu等[18-19]采用混合模式介质MX-Trp-650 M从毕赤酵母发酵液中分离rHSA，经优化，rHSA纯度可达到95%。不过，最佳上样pH为4.0，可能影响HSA分子正常构象。Wu等[20-21]以色胺为配基的新型混合模式介质，用于酵母发酵液中分离rHSA，rHSA单体纯度达到87.8%。此外，疏水相互作用层析也用于rHSA分离，如Dong等[22]采用双水相萃取结合疏水相互作用层析，从毕赤酵母发酵液中分离rHSA，纯度达99.1%。为了提高rHSA分离效率，研发特异性的新型分离介质，吸附和洗脱pH条件温和，且具有耐盐吸附特性，具有重要的意义。
基于计算机分子模拟辅助设计方法，以HSA的位点Ⅱ为靶点，本实验室经设计和筛选得到HSA的特异性配基吲哚-3-乙酸-半胱氨酸(IAA-CYS)，将其偶联于琼脂糖凝胶，制备了新型混合模式介质(IAA-CYS介质)，配基结构见图 1[23]。本研究基于前期工作，实验考察IAA-CYS介质对HSA的吸附性能，针对毕赤酵母发酵液电导率较高、pH对HSA结构影响较大的特点，重点关注pH和盐浓度对rHSA分离的影响，优化分离条件，从毕赤酵母发酵液中高效分离rHSA。
2 材料与方法 2.1 材料
IAA-CYS介质：本实验室按照文献方法制备[20-21, 23]，以质量分数为6% 的琼脂糖凝胶为基质，经烯丙基溴活化，偶联IAA-CYS配基，配基浓度为175 μmol·mL-1，介质粒径为45~165 μm，平均粒径约90 μm；HSA(相对分子量66 700)：Sigma公司；毕赤酵母发酵液：本地生物制药公司提供，pH为6.0，rHSA质量浓度为8 mg·mL-1，纯度3.9%，电导率为20 mS·cm-1；辛酸钠：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白Marker：上海天能科技有限公司；毕赤酵母宿主细胞蛋白检测试剂盒：Cygnus公司；其他为市售分析纯试剂。
2.2 HSA吸附等温线配制20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH=4.5)和添加200 mmol·L-1 NaCl的20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 4.5)。IAA-CYS介质用去离子水充分清洗，并用相应缓冲液平衡30 min，抽滤15 min；称取0.03 g抽干介质，置于2 mL离心管；采用相应缓冲液配制成不同质量浓度(2.4~9.6 mg·mL-1)的HSA溶液，分别取0.8 mL加入离心管中；将离心管放入25 ℃、转速为1 200 r·min-1恒温混匀仪振荡3 h，达到吸附平衡；以3 000 r·min-1的转速离心2 min，沉降介质；用One Drop OD-1000+分光光度计测定上清液在280 nm波长下的吸光度，根据标准曲线得到HSA的平衡浓度C(mg·mL-1)。根据物料衡算计算IAA-CYS介质对HSA的吸附量Q(mg·mL-1)。采用Langmuir吸附平衡式对吸附等温线进行拟合，得到饱和吸附容量Qm(mg·mL-1)和结合常数Ka(mL·mg-1)。Langmuir吸附平衡式如下：
| $ Q=\frac{Q_{\mathrm{m}} \times C}{C+1 / K_{\mathrm{a}}} $ | (1) |
1 mL IAA-CYS介质装填于Tricorn 5/50层析柱(内径5 mm，GE Healthcare公司)，填充高度5 cm。以质量浓度为10 mg·mL-1的HSA溶液(pH 4.5)或含有浓度为200 mmol·L-1 NaCl的质量浓度为10 mg·mL-1的HSA溶液(pH=4.5)作为上样料液。上样前，用平衡缓冲液充分平衡介质。上样流速分别为100、200和300 cm·h-1。UV280 nm在线检测层析柱出口处的HSA浓度变化，绘制穿透曲线，计算10% 穿透时IAA-CYS介质对HSA的动态载量DBC10%(mg·mL-1)。上样结束后，用20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱HSA，再用0.1 mol·L-1的NaOH溶液进行介质清洗和再生。
2.4 毕赤酵母发酵液预处理离心去除发酵液中的毕赤酵母细胞，上清液中加入辛酸钠至20 mmol·L-1浓度，68 ℃水浴30 min，沉淀杂蛋白和灭活蛋白酶，迅速冷却至室温，滴加乙酸溶液调节pH至4.5，以转速1 000 r·min-1离心15 min，0.45 μm滤膜过滤，得到毕赤酵母发酵处理液，rHSA质量浓度为7.6 mg·mL-1，纯度为4.0%。
2.5 rHSA动态载量1 mL IAA-CYS介质装填于Tricorn 5/50层析柱中，填充高度为5 cm。用20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 4.5，含200 mmol·L-1的NaCl)平衡床层，以毕赤酵母发酵处理液为上样料液，上样流速为100 cm·h-1。每0.5 mL收集流穿组分，用SEC-HPLC分析流穿液中的rHSA浓度，绘制穿透曲线，计算10% 穿透时IAA-CYS介质对rHSA的动态载量。上样结束后，用20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱rHSA，再用0.1 mol·L-1的NaOH溶液进行介质清洗和再生。
2.6 洗脱条件优化采用20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)、20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 6.0、7.0、8.0)和20 mmol·L-1甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)配制不同pH和NaCl浓度(200、400、600、800、1 000 mmol·L-1)的缓冲液。96孔过滤板的30个孔中分别加入80 μL IAA-CYS介质悬浮液(含有8 mg介质)，真空抽滤；各孔介质用200 μL、20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 4.5，含200 mmol·L-1的NaCl)平衡3次，真空抽滤，去除缓冲液；各孔加入48 μL毕赤酵母发酵处理液，用封板膜密封96孔过滤板的顶部和底部，放入25 ℃、1 200 r·min-1恒温混匀仪振荡20 min，真空抽滤；用200 μL、20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 4.5，含200 mmol·L-1的NaCl)清洗介质2次；各孔加入不同pH和NaCl浓度的缓冲液，用封板膜密封96孔过滤板的顶部和底部，放入25 ℃、转速为1 200 r·min-1恒温混匀仪振荡10 min，真空抽滤，收集洗脱液，重复2次，合并洗脱液。用SEC-HPLC分析上样料液和洗脱液，计算rHSA纯度和收率。
2.7 毕赤酵母发酵液中分离rHSA1 mL IAA-CYS介质装填于Tricorn 5/50层析柱。20 mmol·L-1乙酸钠缓冲液(pH 4.5，含200 mmol·L-1的NaCl)平衡介质，以毕赤酵母发酵处理液为上样料液，上样量为38.6 mg·mL-1，上样流速为100 cm·h-1；上样后先用20 mmol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 4.5，含200 mmol·L-1的NaCl)淋洗，再用20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 8.0，含200 mmol·L-1的NaCl)洗脱rHSA，收集洗脱液；最后用0.1 mol·L-1的NaOH溶液进行介质清洗和再生。采用SDS-PAGE、SEC-HPLC和ELISA试剂盒分析上样料液和洗脱液。
2.8 SDS-PAGE分析将10 μL电泳缓冲液与40 μL样品混合，95 ℃金属浴10 min。分离胶浓度为10 %，浓缩胶浓度为5 %，样品上样量为10 μL，蛋白Marker上样量为5 μL，80 V恒压电泳30 min，120 V恒压分离45 min，考马斯亮蓝染色，采用Quantity One软件(Bio-Rad公司)分析凝胶图像。
2.9 SEC-HPLC分析采用TSK G3000SWXL分析柱(TOSOH公司)和LC-10A液相色谱仪(岛津公司)，流动相为0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.0，异丙醇体积分数为1 %)，流速为0.6 mL·min -1，上样体积为20 μL，检测波长为280 nm，室温下进行。
2.10 ELISA分析按照毕赤酵母宿主细胞蛋白检测试剂盒说明书进行。
3 结果与讨论 3.1 HSA吸附等温线考察了pH和盐浓度对IAA-CYS介质吸附HSA的影响，发现在pH为4.0~5.0和NaCl浓度为0~1.0 mol·L-1时，HSA吸附量均高于100 mg·mL-1，最合适的吸附pH为4.5。进一步测定了pH为4.5条件下，不添加NaCl和添加浓度为200 mmol·L-1的NaCl时IAA-CYS介质对HSA的吸附等温线，结果见图 2。pH为4.5和不添加NaCl时，HSA饱和吸附容量高达157.6 mg·mL-1，结合常数为7.1 mL·mg-1。褚文宁等[18-19]测定了4种商业化混合模式介质(Capto adhere、Capto MMC、MX-Trp-650M和Nuvia cPrime)对HSA的吸附性能，最佳吸附的pH分别为8.5、4.0、4.0和4.0；吴启赐等[20-21]研发了混合模式新介质TA-B-6FF，也测定了HSA吸附性能，最佳吸附pH为5.0。与上述5种混合模式介质比较，在各自的最佳吸附pH条件下，IAA-CYS介质对HSA的饱和吸附容量最高。pH为4.5和添加200 mmol·L-1的NaCl时，IAA-CYS介质对HSA的饱和吸附容量降到119.8 mg·mL-1，结合常数增大到12.5 mL·mg-1。与上述5种混合模式介质比较，发现相同条件下IAA-CYS介质的饱和吸附容量高于Capto adhere、Nuvia cPrime和TA-B-6FF，与Capto MMC介质接近，略低于MX-Trp-650M介质，且吸附pH较为温和，有利于维持HSA的正常生理构象[6-8]。结果表明，IAA-CYS介质对HSA吸附容量高，条件温和，耐盐性好。
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图 2 IAA-CYS介质对HSA的吸附等温线(pH 4.5) Fig.2 Adsorption isotherm curves of HSA on IAA-CYS at pH 4.5 |
考察了pH为4.5，不同NaCl浓度和线性流速下IAA-CYS介质对HSA的动态载量，穿透曲线见图 3，10% 穿透的动态载量比较见图 4。当线性流速为100 cm·h-1、不添加NaCl时，HSA动态载量达到59.1 mg·mL-1。与Capto adhere、Capto MMC、MX-Trp-650M、Nuvia cPrime和TA-B-6FF等5种混合模式介质比较，在各自最佳吸附pH条件下，IAA-CYS介质的动态载量高于Capto MMC、MX-Trp-650M和Nuvia cPrime介质，略低于Capto adhere介质和TA-B-6FF介质。添加200 mmol·L-1的NaCl时，HSA动态载量仍较高，达到55.2 mg·mL-1，高于上述5种混合模式介质在相同条件下的HSA动态载量。结果表明，NaCl浓度对HSA动态载量影响较小，进一步证实IAA-CYS介质具有较强的耐盐吸附特性。毕赤酵母发酵液的电导率与200 mmol·L-1 NaCl溶液相当，故无需对发酵液进行稀释处理，可以直接上样分离。
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图 3 不同线性流速下IAA-CYS介质对HSA的穿透曲线 Fig.3 Breakthrough curves of HSA on IAA-CYS at different linear velocities |
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图 4 IAA-CYS介质对HSA的10%穿透动态载量比较(pH 4.5) Fig.4 Comparison of DBC10% of IAA-CYS resins for HSA adsorption at pH 4.5 |
从图 4可知，线性流速对HSA动态载量影响较大。不添加NaCl，线性流速从100增大到200 cm·h-1，HSA动态载量从59.1下降到44.8 mg·mL-1，下降了24.2%；当线性流速继续增大至300 cm·h-1，HSA动态载量降至37.2 mg·mL-1，仅为线性流速100 cm·h-1时的62.9%。因此，采用IAA-CYS介质从发酵液中分离rHSA，合适的上样流速为100 cm·h-1。
3.3 rHSA动态载量以毕赤酵母发酵处理液为料液，上样pH为4.5，上样流速为100 cm·h-1，考察了IAA-CYS介质对rHSA的动态载量。穿透曲线见图 5，10% 穿透的动态载量为48.3 mg·mL-1，比纯HSA降低了12.5%，可能是由于发酵液中部分杂质影响了rHSA吸附。后续分离时，选取上样量为动态载量的80%，即38.6 mg·mL-1。比较发现，IAA-CYS介质对rHSA的动态载量高于Nuvia cPrime和TA-B-6FF介质，接近Capto MMC介质和MX-Trp-650M介质。
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图 5 IAA-CYS介质对rHSA的穿透曲线(pH 4.5) Fig.5 Breakthrough curve of rHSA on IAA-CYS at pH 4.5 |
以毕赤酵母发酵处理液为料液，IAA-CYS介质在pH为4.5条件下吸附rHSA，然后以不同pH和NaCl浓度的缓冲液洗脱，考察了pH和盐浓度对rHSA洗脱的影响，不同洗脱条件的rHSA纯度和收率见图 6和7。
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图 6 不同洗脱pH和NaCl浓度下的rHSA纯度 Fig.6 rHSA purities at different elution pH values and NaCl concentrations |
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图 7 不同洗脱pH和NaCl浓度下的rHSA收率 Fig.7 Recoveries of rHSA at different elution pH values and NaCl concentrations |
比较rHSA纯度发现，不添加NaCl，洗脱pH从5.0升高到8.0，rHSA纯度逐步增大到64.5%；pH从8.0升高到9.0，rHSA纯度减小为25.3%；相对而言，pH 8.0洗脱的rHSA纯度最高。对于不同NaCl浓度(0~1.0 mol·L-1)，pH为8.0条件下洗脱的rHSA纯度均为最高。在pH为8.0下，随着NaCl浓度从0升高到1 mol·L-1，rHSA纯度先增大后降低。比较而言，合适的洗脱条件为pH为8.0、NaCl浓度为200 mmol·L-1，rHSA纯度最高，达到76.1%。比较rHSA收率发现，在pH为5.0~9.0时，rHSA收率随着NaCl浓度的升高而增大；NaCl浓度在0~1.0 mol·L-1时，随着pH升高，rHSA收率先增大后减小，pH为8.0下的rHSA收率最大。比较而言，pH为8.0、NaCl浓度为200、400和600 mmol·L-1的rHSA收率较大，分别为88.1%、88.7% 和89.4%。
综合考虑，在pH为8.0、NaCl浓度为200 mmol·L-1下洗脱最合适，具有较高的rHSA纯度和收率。
3.5 毕赤酵母发酵液中分离rHSA根据前文优化结果，以毕赤酵母发酵处理液为料液，进行了rHSA分离。上样pH为4.5，上样流速为100 cm·h-1，上样量为38.6 mg·mL-1，洗脱条件为pH为8.0和NaCl浓度为200 mmol·L-1。
采用SDS-PAGE分析料液和洗脱液，发现料液的主要杂蛋白相对分子量约为45 000和36 000，前者可能是rHSA的降解片段。采用SEC-HPLC分析料液和洗脱液，结果见图 8。分析料液的SEC-HPLC图谱，发现rHSA峰的洗脱时间为16.5 min，在主峰右边有明显的肩峰，与SDS-PAGE分析结果一致，可能是rHSA的降解片段；20~28 min洗脱时间的杂质峰较大，主要是一些小分子杂质。洗脱液的SEC-HPLC图谱中未见明显的小分子杂质峰，rHSA收率为84.6%，纯度为80.2%，经IAA-CYS层析分离rHSA纯度提高了19.3倍。采用ELISA分析了料液和洗脱液中的宿主细胞蛋白含量，分别为2 614.0和714.2 mg·kg-1，减小了72.7%。
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图 8 SEC-HPLC分析 Fig.8 Results of SEC-HPLC analysis |
为了进一步提高rHSA纯度，考虑在洗脱前添加淋洗步骤，以除去部分吸附的杂质。系统比较了不同pH和NaCl浓度的洗脱条件，经SEC-HPLC分析发现，pH为5.0、400 mmol·L-1的NaCl条件下的洗脱液中不含rHSA且小分子杂质含量较高，是较好的淋洗条件。因此，采用前文相同的吸附和洗脱条件，洗脱前添加淋洗步骤，洗脱液的SEC-HPLC分析结果见图 8，rHSA收率为88.6%，纯度提高到90.1%，洗脱液中的宿主细胞蛋白含量降为651.3 mg·kg-1。
褚文宁等[18-19]考察了SP Sepharose FF、Nuvia cPrime、Capto MMC和MX-Trp-650M从毕赤酵母发酵液中分离rHSA，发现SP Sepharose FF和Nuvia cPrime分离rHSA的纯度均较低，仅82% 左右，且SP Sepharose FF分离需要对料液进行稀释预处理；采用Capto MMC和MX-Trp-650M分离效果较好，rHSA收率和纯度均较高，大于95%，不过最佳上样pH为4.0。文献报道，当pH为4.0时HSA分子呈快速迁移的F型结构，与生理条件下的N型结构有较大区别[6-8]。此外，采用Capto MMC分离，洗脱pH为9.0，对HSA分子结构也有一定程度影响[6-8]。吴启赐等[20-21]采用TA-B-6FF从毕赤酵母发酵液中分离rHSA，rHSA单体纯度达到87.8%，收率98.5%，不过介质耐盐性较差，对于酵母发酵液的吸附容量较低，上样量仅为7.2 mg·mL-1介质。比较而言，本研究采用IAA-CYS介质进行分离，上样pH为4.5，洗脱pH为8.0，有利于保持HSA的正常生理构象，且每毫升介质的上样量达到38.6 mg。
总体来说，IAA-CYS介质用于从毕赤酵母发酵液分离rHSA，上样和洗脱条件温和，上样量较大，耐盐性好，料液不用稀释预处理，且分离得到的rHSA纯度和收率均较高。结果表明，IAA-CYS介质具有良好的应用前景。
4 结论针对新型混合模式介质IAA-CYS，探讨了HSA吸附性能，优化了吸附和洗脱条件，实现从毕赤酵母发酵液中高效分离rHSA。系统考察了pH和盐对IAA-CYS介质吸附HAS的影响，经优化，酵母发酵液中分离rHSA的最佳上样条件为pH 4.5，流速100 cm·h-1，每毫升介质的rHSA上样量为38.6 mg；淋洗条件为pH 5.0和400 mmol·L-1 NaCl；洗脱条件为pH 8.0和200 mmol·L-1 NaCl，得到rHSA纯度为90.1%，收率为88.6%。IAA-CYS介质分离rHSA条件温和，过程简便，应用前景良好。
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