肝素是主要的抗凝血药物，临床使用历史悠久。目前，肝素主要是从猪小肠黏膜中提取，它也是我国出口量最大的生化原料药[1]。自从2007年发生的肝素污染事件[2, 3]以来，肝素的生物合成研究受到国内外的重视。近年的研究发现，肝素可以以大肠杆菌K5的荚膜多糖肝素前体 (heparosan) 为原料，经过多步的硫磺基修饰得到[4]。肝素硫磺基修饰过程中需要大量使用3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate, PAPS)。而PAPS却具有价格高且易分解等不利于工业化生产的缺点，因此，PAPS是大规模合成肝素类多糖的一个关键原料[5]。
目前，PAPS再生系统以及酶法合成可以很好解决这个关键问题[6, 7]。PAPS再生系统已被用于制备生物工程肝素[8]。在该系统中，芳基硫磺基转移酶IV (arylsulfotransferase IV) 使用对硝基苯酚硫酸盐 (p-nitrophenol sulfate, PNPS) 作为硫磺基供体将3'-磷酸腺苷5'-磷酸 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphate, PAP) 转化为PAPS[9, 10]。PAPS再生系统满足了PAP的催化量。然而，合成结构确定的超低分子量肝素 (ultralow molecular weight heparin, ULMWH) 时，PAPS被用作唯一的硫磺基供体[5, 11, 12]。
PAPS的酶合成途径如图 1所示，三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 首先在ATP硫化酶 (EC2.7.7.4) 的作用下生成5'-腺苷磷酰硫酸 (adenosine 5'-phosphosulfate, APS), APS在APS激酶 (EC2.7.1.25) 的作用下3'-OH基团与ATP发生磷酸化反应，生成PAPS[9]。Burkart等人[9]使用E. coli K12来源的ATP硫化酶和APS激酶来制备PAPS，底物ATP浓度为5 mmol·L-1时，反应6 h后，PAPS得率仅为30.5%。Zhou等人[6]使用E.coli BL21表达的ATP硫化酶、APS激酶和无机焦磷酸水解酶，可以将PAPS的产量提高到5 g·L-1 (约10 mmol·L-1)。
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图 1 PAPS的合成代谢途径 Fig.1 Pathway of PAPS synthesis |
本研究从乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis) 的基因组中克隆ATP硫化酶基因，根据大肠杆菌密码子偏好性对产黄青霉 (Penicillium chrysogenum) 的APS激酶基因序列进行优化并合成基因。将以上两个不同来源的基因分别构建到质粒中，获得重组表达载体并分别导入大肠杆菌中进行重组表达。经Ni2+亲和层析，分离纯化得到高纯度PAPS合成酶系，研究其合成PAPS的反应条件及性能，并在反应体系中添加无机焦磷酸水解酶 (inorganic pyrophosphatase, PPase), 将PAPS的产量进一步提高。
2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌株及培养基基因克隆宿主为大肠杆菌DH5α (Novangen，USA)，蛋白质表达宿主为大肠杆菌BL21(DE3) (Novangen)，表达载体为pET28a (Novangen)。LB培养基 (g·L-1)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。乳酸克鲁维酵母为实验室保藏。
2.1.2 主要试剂核酸限制性内切酶、DNA连接酶均购自TAKARA (Shiga, Japan)；硫酸卡那霉素 (Kana)、大肠杆菌基因组提取试剂盒、酵母基因组提取试剂盒、小批量质粒提取试剂盒、ATP均购自上海生工；PAPS购自Sigma；Ni-NTA亲和层析填料购自QIAGEN；其余试剂均为分析纯。PPase为本实验室前期制备。
2.2 方法 2.2.1 APS激酶基因的密码子优化合成及表达载体的构建APS激酶基因来源于产黄青霉 (Gene ID: 8313362)，利用在线软件 (http://www.entelechon.com)，按照大肠杆菌密码子偏好性对APS激酶基因进行密码子优化。在目的基因前后插入Nco I和Xho I酶切位点，并在末端添加6个His亲和标签的编码序列。优化设计后的基因由上海捷瑞全合成，并连接到pET28a质粒得到重组载体pET28a-APS Kinase。将重组质粒转入BL21(DE3) 得到重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-APS Kinase。
2.2.2 ATP硫化酶基因克隆及表达载体的构建以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，以5'-cgcccatgggcatgccttctcctcatggtggtg-3'为上游引物，5'-cgcctcgaggaattggaaaaagccttggtcttcc-3'为下游引物进行PCR扩增ATP硫化酶目的基因。分别对ATP硫化酶目的基因片段和pET28a+载体进行Nco I和Xho I双酶切，连接，得到pET28a-ATP sulfurylase。将重组质粒转入BL21(DE3) 得到重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ATP sulfurylase。
2.2.3 ATP硫化酶与APS激酶的诱导表达将重组菌接种于5 mL LB种子培养基 (含50 μg⋅L-1Kana) 中，37℃、220 r⋅min-1培养过夜; 将种子液按2%体积分数转接到100 mL LB培养基中，37℃、220 r⋅min-1培养至菌体生长量达到OD600nm为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.4 mmol⋅L-1，25℃、220 r⋅min-1下诱导6 h。发酵结束后收集菌体，超声破碎，得到的上清液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和后续蛋白提取纯化。
2.2.4 ATP硫化酶与APS激酶的纯化纯化方法采用Ni柱[13]。将适量Ni-NTA填料置于层析柱内。对于ATP硫化酶，用10倍于柱体积的上样缓冲液Buffer A (NaCl 0.5 mol⋅L-1，咪唑20 mmol⋅L-1，Tris-HCl 20 mmol⋅L-1，pH 8.0) 平衡，样品以1 mL·min-1上样，上样后先用Buffer A平衡柱子，再用冲洗缓冲液Buffer B (NaCl 0.5 mol⋅L-1，咪唑70 m mol⋅L-1，Tris-HCl 20 m mol⋅L-1，pH 8.0) 洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液Buffer C (NaCl 0.5 mol⋅L-1，咪唑250 m mol⋅L-1，Tris-HCl 20 m mol⋅L-1，pH 8.0) 洗脱目标蛋白。对于APS激酶，用10倍于柱体积的上样缓冲液Buffer D (NaCl 0.3 mol⋅L-1，咪唑10 mmol⋅L-1，NaH2PO4 50 mmol⋅L-1，pH 8.0) 平衡，样品以1 mL·min-1上样，上样后先用Buffer E (NaCl 0.3 mol⋅L-1，咪唑20 mmol⋅L-1，NaH2PO4 50 mmol⋅L-1，pH 8.0) 平衡柱子，最后用洗脱缓冲液Buffer F (NaCl 0.3 mol⋅L-1，咪唑250 m mol⋅L-1，NaH2PO4 50 m mol⋅L-1，pH 8.0) 洗脱目标蛋白。目标蛋白脱盐浓缩后用Buffer G (Tris-HCl 50 m mol⋅L-1，pH 8.0, 30% (V/V) 甘油) 置于-20℃进行保存。
2.2.5 酶活的测定采用钼酸铵法测定反应生成的Pi来确定PPase的酶活。0.5 mL反应体系中含有100 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH 7.2)、2 mmol⋅L-1 MgCl2和2 mmol⋅L-1焦磷酸 (Pyrophosphoric acid，PPi)，加入适量酶，在25℃反应10 min，阴性对照不加PPi。测试管中含有0.5 mL样品，加入4.0 mL AAM溶液 (10 mmol⋅L-1 (NH4)6Mo7O24·4H2O:2.5 mol⋅L-1 H2SO4:丙酮=1:1:2，体积比)，将溶液在漩涡震荡仪上混合均匀后，往管中加入0.4 mL 1 mol⋅L-1柠檬酸，然后测定405 nm处的吸光值。1 U定义为在上述反应条件下每分钟从焦磷酸催化生成1 μmol Pi所需要的酶量。
ATP硫化酶的测定：通过测定焦磷酸生成量来测定，而焦磷酸的生成量通过加入足量的PPase水解成Pi来测定。0.5 mL反应体系中含有100 mmol⋅L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol⋅L-1 MgCl2、5 mmol⋅L-1Na2MoO4、2 mmol⋅L-1 ATP和0.1 U PPase，在37℃反应15 min，阴性对照不加Na2MoO4。然后通过上述方法测定Pi浓度。1 U定义为在上述反应条件下每分钟从ATP和Na2MoO4催化生成1 μmol PPi所需要的酶量。
2.2.6 PAPS的合成体系以及合成条件的优化500 μL反应体系中：50 mmol⋅L-1Tris-Cl (pH 8.0)，1 mmol⋅L-1 ATP, 5 mmol⋅L-1 Na2SO4，10 mmol⋅L-1 Mg2+，5 mmol⋅L-1 LiCl，加入0.13 U的ATP硫化酶，2 μL的APS激酶以及1 U的PPase (或不加PPase)。在25℃反应30 min，沸水浴10 min，12000 g离心10 min以除去蛋白。单因素变换以查看不同因素对PAPS转化率的影响。考察最优条件下不同底物浓度时PAPS随时间的积累，反应体积为10 mL，且Na2SO4和LiCl浓度是ATP浓度的2倍，在反应体系加入ATP后调节pH，13 U ATP硫化酶，200 μL APS激酶以及100 U的PPase。底物分批补加时反应体积为100 mL，130 U ATP硫化酶，2 mL APS激酶以及1000 U的PPase，反应体系加入ATP后用NaOH调节pH。
2.2.7 产物PAPS的检测采用Agilent 1100 HPLC系统，Zorbax C18柱 (4.6*250 mm，5 μm)，流动相：含有5%甲醇的50 mmol⋅L-1甲酸铵溶液 (用甲酸调节pH至4.5)，流速：1 mL⋅min-1，进样量：5 μL，检测器：UV 254 nm。
使用Bruker LC/MSD离子阱质谱在负离子检测模式进行质谱分析，扫描范围为100~2000 m⋅z-1，分辨率为13, 000 m⋅z-1s-1。对于负离子，毛细管电压为+4000 V，端板为+3500 V，数据由惠普化学工作站收集。
3 结果与讨论 3.1 ATP硫化酶和APS激酶表达与纯化为了构建体外合成PAPS途径，本文构建pET28a-ATP sulfurylase和pET28a-APS kinase两个载体。对构建好的载体使用Nco I和Xho I双酶切验证，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物 (图 2)，将验证无误的载体送去测序验证序列的正确性。
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图 2 质粒pET28a-ATP sulfurylase和pET28a-APS kinase的双酶切鉴定图 Fig.2 Double digestion image of pET28a-ATP sulfurylase and pET28a-APS kinase with Nco I/Xho I M: DNA marker; Lane 1: pET28a-APS kinase; Lane 2: pET28a-ATP sulfurylase |
大肠发酵后收集菌体，加入上样缓冲液浓缩两倍后破胞，离心后取上清。在分离过程中收集穿透液以及洗脱液。上清液、穿透液以及洗脱液经过SDS-PAGE分析 (图 3)，上样量为5 μL。
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图 3 ATP硫化酶和APS激酶的表达以及纯化图 Fig.3 SDS-PAGE analysis of ATP sulfurylase and APS kinase expression and purification Marker: Protein marker; SM: Starting material sample FT: Flow through sample; E: Elution sample |
图 3表明，ATP硫化酶以及APS激酶占菌体可溶蛋白的20%以上，得到有效表达。利用Ni2+柱亲和层析进行纯化，上清液中的重组酶几乎完全被亲和树脂吸附，纯化后的重组酶纯度为90%以上。经BCA蛋白浓度试剂盒测定，保存的ATP硫化酶为7.5 g⋅L-1，APS激酶为9.6 g⋅L-1，PPase为8.3 g⋅L-1。ATP硫化酶的产量为181.1 U⋅L-1发酵液，比酶活为1.78 U⋅mg-1蛋白；APS激酶的产量为351 mg⋅L-1发酵液。
3.2 PAPS合成条件的优化 3.2.1 Mg2+浓度对PAPS合成的影响在PAPS的合成体系中加入不同浓度的Mg2+以考查Mg2+浓度对PAPS合成的影响 (图 4)。由图可见，当合成体系中含有PPase，Mg2+浓度为1 mmol⋅L-1时，PAPS转化率达到最高为78%；当合成体系中不含有PPase时，Mg2+浓度为5 mmol⋅L-1时，PAPS转化率达到最高值36%。在含有PPase时，PAPS的转化率远大于反应体系中不含有PPase的。
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图 4 不同Mg2+浓度对PAPS转化率的影响 Fig.4 Effects of Mg2+ concentration on PAPS conversion |
用HEPES缓冲液 (pH=6.0~8.0) 和Tris-HCl缓冲液 (pH=7.5~9.5) 来考查不同缓冲体系以及pH值对PAPS转化率的影响 (图 5)。由图 5可见，当体系中含有PPase时，50 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH=7.5)，转化率最高为73%；当体系中不含有PPase时，50 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH=8)，转化率最高为46%。可见，在含有PPase时PAPS的转化率远大于不含有PPase的。
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图 5 不同缓冲体系和pH对PAPS转化率的影响 Fig.5 Effects of buffer and pH on PAPS conversion |
在PAPS合成时，变化温度从20~55℃以考查不同温度对PAPS转化率的影响 (图 6)。由图可见，不管是在含有PPase还是在不含有PPase的情况下，反应温度为40℃时，转化率均最高。且在含有PPase时PAPS的转化率远大于不含有PPase时的。
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图 6 不同温度对PAPS转化率的影响 Fig.6 Effects of temperature on PAPS conversion |
综上所述，在反应体系中加入PPase极大地提高了PAPS的转化率，大大提高了反应效率。可能原因是ATP和Na2SO4在ATP硫化酶的作用下生成APS和焦磷酸，而焦磷酸是一种高能物质。PPase水解PPi生成Pi，PPase的添加可以极大地促进反应往合成PAPS方向移动[14]。图 4显示，当合成体系中含有PPase，Mg2+浓度1 mmol·L-1时的PAPS转化率最高；当合成体系中不含有PPase时，Mg2+浓度5 mmol⋅L-1下的PAPS转化率最高。图 5显示：当体系中含有PPase时，在50 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH=7.5) 缓冲溶液中转化率最高；当体系中不含有PPase时，在50 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH=8) 缓冲溶液中转化率最高。据报道[15]，在2 mmol⋅L-1Mg2+、pH 7.2的条件下PPase的酶活最高。通过以上试验，合成PAPS的最优条件为，在PPase存在的前提下，Mg2+浓度为1 mmol⋅L-1、50 mmol⋅L-1Tris-HCl (pH=7.5)、反应温度为40℃。
3.3 最优条件下，不同底物浓度下PAPS随时间的积累量变化在最优反应条件下进一步研究不同底物 (ATP) 浓度下PAPS随时间的积累量变化 (图 7)。由图可见，ATP浓度为10 mmol⋅L-1时，反应1.5 h达到平衡，PAPS积累量为4.36 mmol⋅L-1，ATP转化率为87.2%；ATP浓度为20 mmol⋅L-1时，反应3 h达到平衡，PAPS积累量为8.43 mmol⋅L-1，ATP转化率为84.3%；ATP浓度为30 mmol⋅L-1时，反应9 h达到平衡，PAPS积累量为12.01 mmol⋅L-1，ATP转化率为80.1%；ATP浓度为40 mmol⋅L-1时，反应16 h达到平衡，PAPS积累量为17.46 mmol⋅L-1，ATP转化率为87.3%；ATP浓度为50 mmol⋅L-1时，反应25 h后PAPS积累量为18.87 mmol⋅L-1，ATP转化率为75.5%。ATP硫化酶和APS激酶催化的反应均为可逆反应，随着时间变长，反应达到平衡，因此转化率只能在85%左右，达不到100%。但从图上看出，反应达到平衡后，PAPS的积累量仍是缓慢增加的，这是由于部分ADP被降解为AMP，从而推动平衡向右移动。另一方面，当反应时间为0.5 h和1 h时，PAPS的积累量：10 mmol⋅L-1 > 20 mmol⋅L-1 > 30 mmol⋅L-1 > 40 mmol⋅L-1，这表明在反应过程中存在底物抑制作用。
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图 7 不同底物浓度PAPS随时间的积累量 Fig.7 PAPS accumulation profiles at different substrate concentrations |
反应中，ATP相较于其他底物 (如Na2SO4、LiCl) 价格昂贵，因此在反应过程中考虑提高Na2SO4、LiCl的浓度以推动平衡向右移动，从而提高ATP的转化率。反应体系中ATP 10 mmol⋅L-1，Na2SO4和LiCl浓度分别为20 mmol⋅L-1，50 mmol⋅L-1，100 mmol⋅L-1，200 mmol⋅L-1，500 mmol⋅L-1，反应30 min后，PAPS的生成量分别为3.86 mmol⋅L-1，4.15 mmol⋅L-1，4.30 mmol⋅L-1，4.21 mmol⋅L-1，2.80 mmol⋅L-1。可见，Na2SO4和LiCl浓度小于100 mmol⋅L-1时，浓度越高，反应越快；而Na2SO4和LiCl浓度大于200 mmol⋅L-1时存在明显的底物抑制。因此，在分批补料底物ATP中，Na2SO4和LiCl的初始浓度为200 mmol⋅L-1的条件下，反应过程中对ATP进行分批补料，每次补料量为0.650 g (图 8)。在补料4次下 (此时，ATP的投料浓度为50 mmol⋅L-1)，反应11.5 h，PAPS的积累量达20.36 mmol⋅L-1 (10.32 g·L-1)，转化率为81.4%。即可以从反应液中获得1.03 g PAPS。而在未进行分批补料的模式下，当ATP浓度为50 mmol⋅L-1时，反应25 h PAPS的生成量才为18.81 mmol⋅L-1，分批补料极大地提高了反应的催化速率。另外，PAPS的产量较文献[6]值5 g⋅L-1有了较大的提高。
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图 8 ATP补料下PAPS随时间的积累量 Fig.8 PAPS accumulation profiles under ATP fed-batch conditions |
利用液质联用 (HPLC-MS) 检测最优条件下制备的PAPS样品。HPLC和MS的图谱如图 9所示。在负电模式下，保留时间为3.648 min的液相峰所检测到的质荷比 (m·z-1) 为505.7，而C10H15N5O13P2S (M-H) 的理论计算m⋅z-1为506.0，两者相一致。之前的文献报道[6]采用PMAN-HPLC对PAPS进行检测一个样品的分析时间为50 min，本文采用甲酸甲酸铵反向离子对HPLC一个样品的分析时间仅为10分钟，并且该流动相适合用于MS分析。
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图 9 PAPS的液相图以及质谱图 Fig.9 HPLC and MS spectra of PAPS |
PAPS是酶法合成肝素所必需的硫磺基供体。但PAPS价格非常昂贵，远高于肝素，这成为体外合成肝素的严重障碍。本研究利用基因工程表达了ATP硫化酶和APS激酶，并将它们构建成PAPS酶反应体系，实现了PAPS的体外合成。同时在反应体系中添加了PPase，PPase可以水解ATP硫化酶生成的PPi，从而可以极大地促进反应往正方向移动。在优化的反应条件下，考察在不同底物ATP浓度下PAPS随时间的积累量，除ATP浓度为50 mmol·L-1外，ATP的转化率均可达到85%左右；同时发现反应存在底物抑制作用。考察不同Na2SO4和LiCl浓度对PAPS的生成量的影响，结果显示当Na2SO4和LiCl浓度为200 mmol·L-1时反应最优。控制反应中Na2SO4和LiCl初始浓度为200 mmol·L-1，在反应中对ATP进行分批补料，补料4次，反应11.5 h，PAPS的积累量达20.36 mmol·L-1(10.32 g·L-1)，ATP的转化率为81.4%，即可以从反应液中获得1.03g PAPS，相较于非补料模式极大地提高了反应的催化速率。
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