临床上使用的药物大多为手性药物，蛋白质、生物酶、核糖核酸等本身都具有手性，当手性药物进入生物体后，与生物大分子产生严格的立体匹配，从而导致药物对映体显示出不同的药理和毒理作用[1, 2]。氧氟沙星是典型的抗菌消炎类手性药物，对于革兰阴性菌所导致的呼吸道、肠道等各类感染有较好的治疗效果。而其中L-氧氟沙星的抗菌活性是D-氧氟沙星的8到128倍，是氧氟沙星消旋体的2倍[3]。因此获得单一的L-氧氟沙星具有重要意义。
传统的手性药物的制备方法可分为两大类：一类是手性合成法，即直接合成出所需对映体；另一类是将外消旋体拆分为对映体[4]。但是不对称合成工艺较复杂且成本较高[4, 5]，所以有近85%~90%的药物还是以外消旋体的形式生产、销售以及使用[6]，因此研究快速高效的拆分方法具有现实意义。常用的手性拆分方法有结晶法[7]、色谱法[8]、酶促拆分法[9]、膜拆分法[10]，但大都由于拆分成本高，制备规模小，适用范围窄而难以用于实际生产。液液萃取方法由于其设备简单，能耗低，常温常压等优点，易于实现大规模生产，因此也逐渐用于对映体拆分领域。近几年，也已经有部分学者利用手性溶剂液液萃取技术进行了氧氟沙星对映体的手性拆分研究[11]。目前报道的多是用酒石酸衍生物作为拆分剂用于氧氟沙星的手性拆分。唐课文等使用L-二苯甲酰酒石酸作为拆分剂，在氧氟沙星浓度为140 ppm时，萃取选择性系数为1.18[12]；王林生等使用L-对甲基二苯甲酰酒石酸与L-二苯甲酰酒石酸作为混合萃取剂拆分氧氟沙星，在氧氟沙星浓度为100 ppm时，选择性系数为2.43[13]。但目前已有的研究中，由于氧氟沙星在水相的溶解度很低，导致萃取拆分氧氟沙星时其水相浓度都较低，文献中报道的最高拆分浓度为200 ppm，单次拆分量过少，因此设法提高氧氟沙星在水相中的浓度，并寻找一种新型的可以有效拆分较高浓度的氧氟沙星的方法势在必行。
由于乙酸分子与氧氟沙星分子可以形成氢键，乙酸作为助溶剂可以较大地提高氧氟沙星在水中的溶解度[14]。本文将乙酸作为助溶剂，以获得较高浓度的氧氟沙星水溶液(＞10000 ppm)，进一步利用L-酒石酸二乙酯为萃取剂[3]，在较低pH值下拆分较高浓度氧氟沙星消旋体，并考察萃取时间、萃取温度、萃取剂浓度、氧氟沙星浓度等对萃取效果的影响，优化拆分萃取条件，以期为较高浓度的氧氟沙星的拆分工艺过程提供参考。
2 实验部分 2.1 试剂与仪器L-酒石酸二乙酯(分析纯，纯度99.0%，C8H15PF6N2，上海阿拉丁生化科技有限公司)；氧氟沙星(分析纯，纯度98%，C18H20FN3O4，上海阿拉丁生化科技有限公司)；正辛醇(分析纯，纯度99.0%，C8H18O，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸(分析纯，纯度99.7%，C2H4O2，国药集团化学试剂有限公司)；硫酸铜(分析纯，纯度99.0%，CuSO4，国药集团化学试剂有限公司)；L-亮氨酸(分析纯，纯度99.0%，C6H13NO2，上海阿拉丁生化科技有限公司)；甲醇(分析纯，纯度99.9%，CH4O，国药集团化学试剂有限公司)；去离子水。
SHZ-B水浴恒温振荡器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；Agilent 1100 Infinity型液相色谱(安捷伦有限公司)；FA1004A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。
2.2 实验过程 2.2.1 氧氟沙星在乙酸-水溶液中的溶解度测定分别配置浓度为100 ppm，150 ppm，200 ppm，250 ppm，300 ppm的氧氟沙星标准溶液，通过HPLC法分析，并将峰面积绘制成标准曲线。分别配置不同浓度的乙酸水溶液，加入氧氟沙星至过饱和，充分溶解后取上层清液稀释后进行HPLC分析，得到峰面积，通过标准曲线方程得到氧氟沙星浓度。
2.2.2 液液平衡时间的确定取0.05 g氧氟沙星溶于5 mL浓度为0.1 mol·L-1的乙酸溶液中，获得10000 ppm的氧氟沙星溶液；取0.5 mol·L-1的L-酒石酸二乙酯的正辛醇溶液5 mL，分别加入到刻度离心管中，再放入水浴振荡器里恒温振荡，振荡频率200次·min-1，温度控制在25℃，开启振荡，使两相充分混合。分别振荡30、60、90 min、0、150、180 min后停止振荡，静置分层，上层为水相、下层为有机相，记录两相体积。取1 mL水相，用去离子水稀释100倍后用HPLC法分析其中所含L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的浓度。然后再根据总体系氧氟沙星对映体的质量平衡和萃取前后体积值，可以计算出正辛醇中氧氟沙星L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的浓度。
2.2.3 液液萃取实验数据的测定将一定量的氧氟沙星溶于一定浓度的乙酸水溶液中得到水相，将一定量的L-酒石酸二乙酯溶于正辛醇中得到有机相。分别取5 mL水相和有机相混合，在一定温度下进行强烈震荡，震荡完毕后，两相静止分层后取水相稀释一定倍数后进行HPLC分析，得到水相中L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的浓度，有机相中L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的浓度采用差减法[12]求得。
2.3 分析方法采用高效液相色谱仪Waters 600CONTROLLER系统和紫外检测器，Agilent 1100 Infinity型色谱数据处理机，4.6 mm×250 mm kromasil C18柱。在流动相中添加了L-亮氨酸和硫酸铜，L-亮氨酸的浓度为10 mmol·L-1，硫酸铜浓度为5 mmol·L-1。流动相是由甲醇与水按体积比12:88配成[15]。流动相流速为0.25 mL·min-1，紫外检测器检测波长为294 nm，分离柱柱温为25℃。L-氧氟沙星与D-氧氟沙星在有机相中的浓度由质量衡算得到。氧氟沙星消旋体的液相色谱谱图如图 1所示。
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图 1 氧氟沙星消旋体水溶液高效液相色谱图 Fig.1 HPLC chromatogram of ofloxacin solution |
在平衡时L-氧氟沙星和D-氧氟沙星的分配系数K和对映体选择性系数α通过式(1-a)、(1-b)与(2) 计算：
| ${{K}_{\text{L}}}\text{=}\frac{有机相中L\text{-}氧氟沙星浓度}{水相中L\text{-}氧氟沙星浓度}$ | (1-a) |
| ${{K}_{\text{D}}}\text{=}\frac{有机相中D\text{-}氧氟沙星浓度}{水相中D\text{-}氧氟沙星浓度}$ | (1-b) |
| $\alpha \text{=}\frac{{{K}_{\text{D}}}}{{{K}_{\text{L}}}}$ | (2) |
实验测定了浓度为50 ppm，100 ppm，150 ppm，200 ppm，250 ppm，300 ppm的氧氟沙星标准溶液HPLC色谱的峰面积，并绘制了标准曲线，如图 2所示，拟合的直线方程为：y=485.5475x-289.4，R2=0.9996。可见氧氟沙星浓度在50 ppm~250 ppm范围内线性良好。
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图 2 标准曲线 Fig.2 Standard curve for ofloxacin concentration measurements |
在温度为25℃时，测定了乙酸浓度对氧氟沙星溶解度的影响，如图 3所示。可以看出，随着乙酸浓度的逐渐变大，氧氟沙星的溶解度也不断变大，但是变大趋势放缓。
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图 3 乙酸浓度对氧氟沙星溶解度的影响 Fig.3 Effects of HAc concentration on ofloxacin solubility |
实验考察了萃取时间对拆分效果的影响，确定了液液平衡时间。在温度为25℃时，用0.5 mol·L-1 L-酒石酸二乙酯的正辛醇溶液萃取10 g·L-1(10000 ppm)氧氟沙星的乙酸水溶液，相比为1:1，所测得L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的分配系数与选择性系数随萃取时间的变化如图 4、图 5所示。可见，在充分振荡的条件下，L-酒石酸二乙酯萃取水中氧氟沙星对映体的时间超过120 min后，选择性系数基本不变，萃取过程达到平衡。根据实验具体情况，为了确保达到液液平衡，萃取时间定为135 min。
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图 4 萃取时间对分配系数的影响 Fig.4 Effects of extraction time on distribution coefficient t = 25 ℃ c (ofloxacin) = 10000 ppm, c (diethyl L-tartrate)=0.5 mol·L-1, c (HAc)=0.1 mol·L-1 |
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图 5 乙酸浓度对分配系数的影响 Fig.5 Effects of HAc concentration on distribution coefficient t =25 ℃ c(ofloxacin) = 10000 ppm, c(diethyl L-tartrate) = 0.5 mol·L-1 |
实验考察了乙酸浓度对拆分效果的影响。实验中有机相L-酒石酸二乙酯浓度为0.5 mol·L-1，水相中氧氟沙星浓度为10000 ppm。从图 5可以看到，随着乙酸浓度的上升，L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的分配系数逐渐变小。图 6可以看出，在一定范围内，氧氟沙星对映体的选择性系数随乙酸浓度的增大而增大；乙酸浓度高于0.1 mol·L-1时，选择性系数基本维持稳定。而乙酸浓度增加时L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的分配系数降低，所以确定乙酸的最佳浓度为0.1 mol·L-1。
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图 6 乙酸浓度对选择性系数的影响 Fig.6 Effects of HAc concentration on selectivity t = 25℃, c(ofloxacin)=10000 ppm, c(diethyl L-tartrate) = 0.5 mol·L-1 |
考察了不同浓度的L-酒石酸二乙酯的正辛醇溶液对氧氟沙星对映体的分配系数和选择性系数的影响。氧氟沙星浓度为10000 ppm，温度为25℃，乙酸浓度为0.1 mol·L-1时，氧氟沙星对映体的分配系数与选择性系数分别如图 7、图 8所示。从图 8中可以看到，当有机相中L-酒石酸二乙酯浓度为零时，对映体选择性系数为1.02，接近1，而且D-氧氟沙星与L-氧氟沙星的分配系数都很小，说明在没有L-酒石酸二乙酯存在时，氧氟沙星基本上不会被拆分开。随着有机相中L-酒石酸二乙酯的浓度不断增大，D-氧氟沙星与L-氧氟沙星的分配系数逐渐变大。在L-酒石酸二乙酯浓度小于0.6 mol·L-1时，氧氟沙星对映体的选择性系数随着的浓度增大而增大，在L-酒石酸二乙酯的浓度为0.6 mol·L-1时达到最大值。随着L-酒石酸二乙酯浓度的进一步增大，对映体选择性系数随之下降。故选择有机相中L-酒石酸二乙酯的合适浓度为0.6 mol·L-1。
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图 7 L-酒石酸二乙酯浓度对分配系数的影响 Fig.7 Effect of diethyl L-tartrate concentration on distribution coefficient t=25℃, c(ofloxacin)=10000 ppm, c(HAc)=0.1 mol·L-1 |
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图 8 L-酒石酸二乙酯浓度对选择性系数的影响 Fig.8 Effects of diethyl L-tartrate concentration on selectivity t = 25 ℃ c (ofloxacin) = 10000ppm, c (HAc) = 0.1 mol·L-1 |
氧氟沙星浓度会影响手性拆分剂与氧氟沙星消旋体形成的复合物的浓度，会对氧氟沙星对映体分配系数和选择性系数产生影响。有机相中L-酒石酸二乙酯的浓度为0.6 mol·L-1，萃取拆分温度为25℃的体系下，考察了氧氟沙星浓度从5000 ppm到20000 ppm情况下L-氧氟沙星与D-氧氟沙星的分配情况。萃取拆分结果如图 9、图 10所示，当氧氟沙星浓度为12000 ppm时，选择性系数达到最大。
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图 9 氧氟沙星浓度对分配系数的影响 Fig.9 Effects of ofloxacin concentration on distribution coefficient |
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图 10 氧氟沙星浓度对选择性系数的影响 Fig.10 Effects of ofloxacin concentration on selectivity t=25 ℃ c (diethyl L-tartrate)=0.6 mol·L-1, c (HAc)=0.1 mol·L-1 |
实验考察了温度对拆分效果的影响，实验中水相乙酸浓度为0.1 mol·L-1，有机相L-酒石酸二乙酯浓度为0.6 mol·L-1，氧氟沙星消旋体浓度为12000 ppm，实验考察的温度范围是25~65℃。实验结果如图 11、图 12所示。从图中可以看出，L-氧氟沙星和D-氧氟沙星的分配系数随着温度的上升明显增大，而对映体选择性系数却随着温度的上升而下降。L-氧氟沙星和D-氧氟沙星的分配系数的增大说明非选择性的物理分配过程随着温度的升高而增加，而对映体选择性系数的下降则是由于手性拆分剂对对映体的区分作用随着温度的升高而降低所致[16]。
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图 11 温度对分配系数的影响 Fig.11 Effects of temperature on distribution coefficient c (ofloxacin)=12000 ppm, c (diethyl L-tartrate)=0.6 mol·L-1, c (HAc)=0.1 mol·L-1 |
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图 12 温度对选择性系数的影响 Fig.12 Effects of temperature on selectivity c (Ofloxacin)=10000 ppm, c (diethyl L-tartrate)=0.5 mol·L-1, c (HAc)=0.1 mol·L-1 |
由此，优化后的萃取条件为L-酒石酸二乙酯的浓度0.6 mol·L-1，氧氟沙星浓度12000 ppm，乙酸浓度0.1 mol·L-1，体系温度25℃，此时选择性系数为1.39，实现了氧氟沙星拆分浓度与对映体选择性系数的同步提升。
3.7 van't Hoff方程回归van't Hoff方程是由Jacobus Henricus van't Hoff在1884年提出的[17]，方程给出了在温度变化时，过程的标准焓变与平衡常数的关系，其形式为：
| $\text{ln}K\text{=}-\text{(}\Delta H\text{/}RT\text{)+(}\Delta S\text{/}R\text{)+}\ln \varphi $ | (3) |
式中，△H为萃取过程中的焓变，△S为萃取过程中的熵变，φ为有机相与水相体积比。lnK~1/T应该是一条斜率为△H/R，截距为(△S/R)+lnφ的直线，在本实验中，有机相与水相体积比为1:1，则lnφ值为零。如果在萃取温度变化过程中，手性选择剂或者氧氟沙星消旋体的结构发生了变化，则van't Hoff方程会在不同的温度范围内有不同的斜率和截距值。此外，对映体选择性系数α可以表现出手性拆分剂对两种对映体相互作用活化能的不同[17]：
| $\text{ln}\alpha \text{=}-\Delta (\Delta G)=-\text{ }\!\![\!\!\text{ }\Delta (\Delta H)\text{/R}T\text{ }\!\!]\!\!\text{ + }\!\![\!\!\text{ }\Delta (\Delta S)\text{/}R\text{ }\!\!]\!\!\text{ }$ | (4) |
实验中水相乙酸浓度为0.1 mol·L-1，有机相L-酒石酸二乙酯浓度为0.6 mol·L-1，水相氧氟沙星消旋体浓度为12000 ppm。
由图 11、图 12的数据，分别代入式(3) 与(4) 中，以DD、DL以及α的自然对数作为纵坐标，以温度的倒数为横坐标，拟合得到三条直线(图 13、图 14中的直线)，直线方程分别为lnKD=0.56893-680.17/T，R2=0.9990；lnKL=1.49654-1055.12/T，R2=0.9999；lnα=-0.9276+374.95/T；R2=0.9970。lnKD~1/T，lnKL~1/T与lnα~1/T均在实验温度范围内呈现线性，这说明在实验研究的温度范围内，手性拆分剂与氧氟沙星消旋体所形成的复合物在构型上没有发生变化，同时对映体选择性相互作用也没有发生变化[18]。
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图 13 lnK与1/T拟合 Fig.13 Fitting results of lnK and 1/T |
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图 14 lnα与1/T拟合 Fig.14 Fitting results of lnα and 1/T |
(1) 乙酸作为助溶剂可以大幅度地提高氧氟沙星在水中的溶解度，随着乙酸浓度的增加，氧氟沙星的溶解度也逐渐增加，但是增加趋势逐渐变缓。乙酸浓度为0.1 mol·L-1时，此时氧氟沙星的溶解度达37.77 g·L-1。
(2) L-酒石酸二乙酯可以较好地拆分氧氟沙星消旋体。在L-酒石酸二乙酯的浓度为0.6 mol·L-1，氧氟沙星浓度为12000 ppm，乙酸浓度为0.1 mol·L-1，体系温度为25℃时，对映体选择性系数达到1.39。相比于已有的研究结果[12, 13]，实验结果实现了氧氟沙星拆分浓度与对映体选择性系数的同步提升。
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