DOI: 10.3969/j.issn.1674-2591.2016.01.009
0

引用本文

程强, 李硕, 刘刚. 尾悬吊法小鼠骨质疏松模型的建立与评价[J]. 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2016, 9(1): 52-58
CHENG Qiang, LI Shuo, LIU Gang. Establishment and evaluation of a disuse osteoporotic mouse model[J]. Chinese Journal of Osteoporosis and Bone Mineral Research, 2016, 9(1): 52-58

工作空间

尾悬吊法小鼠骨质疏松模型的建立与评价
程强1, 李硕2, 刘刚1     
1.210002 南京，南京大学医学院附属金陵医院骨科;
2.710032 西安，第四军医大学基础部药理学教研室
收稿日期: 2016-01-20
基金项目: 江苏省六大人才高峰(2013-WSN-091)
通信作者: 刘刚，E-mail：liug2002xian@163.com
摘要：目的 通过尾悬吊法建立一种废用性小鼠骨质疏松模型并对其进行评价。方法 32只C57BL/6J雄性小鼠,采用随机数表法分为4组,即尾悬吊(tail-suspension,TS)14 d组及其对照组(control 1,C1),尾悬吊14 d后解除悬吊14 d组(tail-suspension+rest,TS+R)及其对照组(control 2,C2)。采用显微计算机断层扫描(computed tomography,CT),生物力学和形态学方法评估小鼠骨质流失情况。结果 TS组和TS+R组股骨长度较各自对照组分别下降8.23%和7.68%。两悬吊组股骨小梁骨密度与各自对照组相比分别下降26.80%和20.52%,骨体积分数,骨小梁厚度、数目也明显下降,骨小梁间隙显著升高,TS组皮质骨密度较C1组下降8.51%。两悬吊组的股骨最大载荷较其对照组分别下降23.01%和18.54%,TS组弯曲弹性模量较C1组下降21.99%,TS与TS+R两组的下降程度之间比较,差异有统计学意义(t=6.462,P=0.008)。形态学方面,TS和TS+R组成骨细胞数比各自对照组低47.76%和41.44%,破骨细胞数较各自对照组高30.06%和16.93%,生长板厚度以及软骨细胞数等明显少于各自对照组,TS组胶原纤维面积较其余3组明显缩小。结论 雄性C57小鼠尾悬吊14 d表现出显著骨质疏松,解除悬吊14 d后骨质流失状况未显著改善,尾悬吊法小鼠骨质疏松模型具有造模时间短,效果明显、作用稳定等特点,值得进一步推广运用。
关键词： 骨质疏松    尾悬吊    显微CT    生物力学    形态学    
Establishment and evaluation of a disuse osteoporotic mouse model
CHENG Qiang1, LI Shuo2, LIU Gang1     
1.Department of Orthopedics, Jinling Hospital, Clinical School of Nanjing, The Second Military Medical University, Nanjing 210002, China;
2.Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
Abstract: Objective To establish a disuse osteoporosis mouse model by tail-suspension and observe its structural and morphological changes and mechanical properties of mice.Methods Thirty two male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups. TS group:mice were tail-suspended for 14 days. TS+R group:mice were tail-suspended and rest for 14 days respectively. C1 and C2 groups:mice were normally feed for 14 days or 28 days. All mice were sacrificed at predetermined time points. Then micro-CT, biomechanic tests and morphological observations were completed.Results The femural length of TS-treated groups decreased by 8.23% and 7.68%, and bone mineral density decreased by 26.80% and 20.52% compared with C1 and C2 groups respectively. The bone volume fraction, trabecular bone thickness and number in TS-treated groups were significantly lower than the control groups, while the trabecular seperation was higher than the control groups. The cortical BMD of TS group declined by 8.51% compared with C1 group. By biomechanical tests, the maximal load of femur in TS-treated groups dropped by 23.01% and 18.54% respectively, the elastic modulus of TS group failed by 21.99% compared with C1 group, and the diversities between TS and TS+R groups and their respective control groups showed a signifcant difference(t=6.462, P=0.008). The results of biomechanical parameters showed high risk of fracture in TS-treated groups. By histological observation, the number of osteoblasts decreased by 47.76% and 41.44%, while number of osteoclasts increased by 30.06% and 16.93% compared with C1 and C2 groups respectively. Furthermore, the number of chondrocytes and thickness of growth plate in TS-treated groups were obviously lower than that in the control groups, and the area of collagen in TS group was less than the other three groups. Conclusion Significant changes of mice femurs were seen in TS group, the trabecular bone structure and biomechanical properties were damaged, and histological degeneration was found. Most of bone-associated parameters in TS+R group were stable, even the mice were released for 14 days. These results demonstrate that it is worthful to promote the new osteoporotic mouse model in the furture, because it is effective, steady and timesaving obviously.
Key words: osteoporosis    tail-suspension    micro-CT    biomechanics    morphology    

骨质疏松症是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征,骨脆性和骨折风险增高的代谢性骨病,其引起的疼痛和骨折严重影响患者的生活质量[1],骨质疏松的作用机制十分复杂,目前尚未完全明确。各年龄段人群中均有发生,主要包括绝经后骨质疏松、废用性骨质疏松以及药物诱导性骨质疏松等类型。动物模型既可避免实验研究对人体造成的伤害,还能以较短的时间模拟疾病病理状态,为研究骨质疏松症的发生、发展以及治疗药物提供了一种重要手段[2]。绝经后骨质疏松动物模型通过切除雌性动物双侧卵巢建立;药物诱导性骨质疏松在人类十分常见,但药物不良反应较大,影响动物正常代谢且效果不稳定,目前缺乏稳定的动物模型[3]。废用性骨质疏松模型主要采用尾悬吊,坐骨神经切除,肌腱离断或者机械固定等方法,其中以尾悬吊法最为常见,是研究瘫痪、骨折等患者及航天员失重状态下出现骨质疏松的重要手段[4]。

尾悬吊法最早在1979年由Morey等[5]提出,用于模拟宇航员失重状态的研究。研究发现,大鼠尾悬吊后,比目鱼肌萎缩明显,骨生长受限,生物力学性能退化,胶原代谢紊乱,骨转化增强,而骨钙素以及转化生长因子β,前列素E2等血清指标明显下降[6, 7, 8]。尾悬吊模型在一定程度上体现了骨骼肌与骨骼之间的关系,是一种可以较好地模拟人体骨质疏松过程的方法。目前尾悬吊法多以大鼠为主,但大鼠骨皮质重建活性较低,不宜用于评价可促进骨哈佛氏系统重建药物的研究[9],小鼠则以各种骨代谢相关基因敲除小鼠的研究为主。不同品系小鼠对尾悬吊适应性迥异,其中以C57BL背景的小鼠悬吊后骨质流失个体差异性最小[10],生长期小鼠对悬吊最敏感[11]。本文结合文献[12, 13],自制了一种小鼠悬尾装置,观察尾悬吊14 d后以及经过14 d缓解后雄性C57小鼠股骨骨质流失情况,并探讨建立一种废用性骨质疏松模型的可行性。

材料与方法 实验分组和造模

32只8~10周龄健康雄性C57BL/6J小鼠 (23~25 g),由第四军医大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(陕)2008-005。采用数表法随机分为4组,即尾悬吊14 d组(tail-suspension,TS)以及相应的对照组(control 1,C1),悬尾14 d后休息14 d组(TS+rest,TS+R)和相应的对照组(control 2,C2),每组8只。造模前小鼠适应性饲养1周,采用自制装置建立尾悬吊模型(图1),在(23±2)℃的室温环境中饲养,对照组除无悬吊处置外,其余与悬吊组一致。本实验相关动物使用遵守《第四军医大学动物实验管理条例》。

图1 小鼠尾悬吊装置示意图 Fig.1 Device of mouse
图选项
标本采集

实验过程中密切关注小鼠活动,避免出现排泄物堵塞引起的感染。14 d后分别断颈处死TS和C1组小鼠,28 d后处死TS+R和C2组小鼠,取各组小鼠双侧股骨,用0.9%氯化钠注射液浸润的纱布包裹,-70 ℃保存。

Micro CT扫描及重建分析

显微CT是一种非侵入性评估手段,为骨质疏松程度提供准确的定性及定量分析[14]。每组取4根左侧股骨,用小动物显微CT(Inveon公司,德国西门子公司)进行扫描重建。选取股骨髁生长板近端1.0~1.5mm处(图2A1)和股骨中段0.5 mm区域(图2A2)作为感兴趣区(region of interest,ROI),采用Mimics软件(版本10.0,美国Materialise公司)分析ROI骨小梁骨矿物质密度(bone mineral density,BMD),骨相对体积(bone volume/total volime,BV/TV)、小梁数量(trabecular bone number,Tb.N)、小梁分离度(trabecular bone separation,Tb.Sp)、小梁厚度(trabecular bone thickness,Tb.Th),皮质骨BMD,表面积(cortical area,Ct.Ar)、厚度(cortical thickness,Ct.Th)等指标。

图2 显微CT扫描不同组小鼠股骨ROI及三维重建图 Fig.2 3D pictures of ROI among different groups by 编号1~4分别对应TS,C1,TS+R和C2组;A1:ROI矢状面; A2:ROI冠状面;B1~4和C1~4分别是不同组小鼠股骨矢状面和冠状面示意图;D1~4和E1~4分别为ROI三维重建图;ROI:感兴趣区
图选项
生物力学检测

取小鼠右侧股骨在3 d内利用电子三点弯曲疲劳试验机(型号ELF3520,美国BOSE公司)进行3点弯曲测试,测试股骨中段生物力学性能。参数:速度1.2 mm/min,跨距8 mm至股骨断裂。随后使用游标卡尺量取断端内外径以及皮质骨厚度,重复3次取平均值。根据结果绘制载荷-变形曲线,记录最大载荷(max loading),根据公式计算弯曲弹性模量(elastic modulus)等指标[15]。

形态学检查

每组取4根新鲜的左侧股骨,浸泡于4%多聚甲醛溶液中,EDTA脱钙,石蜡包埋,用于RANKL、TRAP、甲苯胺蓝以及Masson染色。RANKL染色观察成骨细胞形态,TRAP染色观察破骨细胞形态,甲苯胺蓝染色用于观察生长板和软骨细胞形态,Masson染色用于观察股骨远端纤维化程度。每根股骨各选取两张200倍镜染色图片,使用Image Pro Plus软件(版本6.0,美国Cybernetics公司)分析后取平均值进行统计。

统计学方法

所有数据均采用SPSS17.0(美国IBM公司)进行统计分析,数据以均值±标准误(±s)表示,尾悬吊组与其对照组之间采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果 一般状

小鼠一般状况良好,未出现明显感染、脱毛等情况,悬尾过程中均处于后肢离地状态,无意外死亡。不同组小鼠体质量,股骨长度变化情况见表1,监测体质量变化情况发现小鼠悬吊3 d后体质量达到谷底,随后缓慢上升,至14 d或28 d时与各自对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。TS组和TS+R组股骨长度较各自对照组分别下降8.23%和7.68%,而两组股骨长度下降程度之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 不同组小鼠体质量与股骨长度变化 Table 1 Changes of mice's body weights and femural
组别体质量(g)股骨长度(mm)
0 d 14 or 28 d
C1组(n=8)24.14±0.4226.45±0.7616.40±0.16
TS组(n=8)24.21±0.3625.32±0.6215.05±0.05*
C2组(n=8)24.27±0.5128.02±0.6416.53±0.14
TS+R组(n=8)24.62±0.4627.63±0.8715.26±0.11*
C1:尾悬吊14 d对照组;TS:尾悬吊14 d组; C2:尾悬吊14 d+休息后14 d对照组; R:休息14 d; 尾悬吊组与各自对照组比较,*P<0.05
表选项
显微CT扫描结果

显微CT对骨的微观结构进行定量分析,可见TS组和TS+R组的骨小梁BMD与各自对照组相比分别下降26.80%和20.52%,悬吊导致小梁骨相对体积、厚度、数量等指标明显下降,小梁分离度显著升高(表2),但上述指标的变化在TS组和TS+R组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。TS组BMD较C1组下降8.51%,而TS组和TS+R组表面积和厚度与各自对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)(表3)。显微CT扫描可见TS组和TS+R组股骨远端骨小梁区域较对照组明显稀疏,结构不清(图2)。小梁骨三维重建可更加直观的发现TS组和TS+R组的小梁结构破坏,空洞明显,而4组皮质骨形态正常,结构完整(图2)。

表2 不同组小鼠小梁骨空间结构参数 Table 2 Changes of mice's trabecular stuctural parameters among different groups
小梁骨检测指标BMD(mg/cm3)BV/TV(%)Tb.Th(μm)Tb.N(N)Tb.Sp(μm)
C1组(n=4) 351.69±21.35 31.90±2.70 52.18±6.68 5.42±0.84 130.65±12.03
TS组(n=4) 257.44±15.17** 6.77±0.71** 32.25±3.52* 2.01±0.33** 442.20±26.05**
C2组(n=4) 336.78±22.73 29.34±2.48 54.94±5.86 5.85±0.78 134.98±14.21
TS+R组(n=4) 267.73±17.48* 8.01±0.87* 38.53±3.13* 2.32±0.64** 420±30.12**
BMD:骨小梁骨矿物质密度; BV/TV:小梁骨相对体积; Tb.Th:小梁骨厚度; Tb.N:小梁骨数量; Tb.Sp:小梁骨分离度; 尾悬吊组与各自对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表选项

表3 不同组小鼠皮质骨空间结构参数 Table 3 Changes of mice's cortical stuctural parameters among different groups
组别BMD(mg/cm3)Ct.Ar(mm3)Ct.Th(μm)
C1组(n=4)1209.41±35.360.67±0.080.20±0.03
TS组(n=4)1106.41±34.98*0.56±0.100.18±0.02
C2组(n=4)1235.95±33.870.71±0.090.21±0.02
TS+R组(n=4)1172.19±24.550.63±0.110.19±0.03
C1:尾悬吊14 d对照组;TS:尾悬吊14 d组; C2:尾悬吊14 d+休息后14 d对照组; R:休息14 d; BMD:骨小梁骨矿物质密度; Ct.Ar:皮质骨表面积, Ct.Th:皮质骨厚度;尾悬吊组与各自对照组比较,*P<0.05
表选项
生物力学检测结果

尾悬吊导致TS组和TS+R组最大载荷较各自对照组下降23.01%和18.54%,两组间下降程度相比,差异无统计学意义(P＞0.05),TS组弯曲弹性模量较C1组下降21.99%,TS+R组与C2组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)(表4),两组下降程度间比较,差异有统计学意义(t=6.462,P=0.008)。

表4 不同组小鼠股骨生物力学指标 Table 4 Mechanical properties of mice's femurs among different groups
组别最大载荷(N)弯曲弹性模量(MPa)
C1组(n=8) 14.25±1.34 3792.61±329.26
TS组(n=8) 10.97±1.13* 2958.80±285.73**
C2组(n=8) 14.45±1.56 3749.17±366.87
TS+R组(n=8) 11.77±1.47* 3687.15±374.20
C1:尾悬吊14 d对照组;TS:尾悬吊14 d组; C2:尾悬吊14 d+休息后14 d对照组;R:休息14 d; 尾悬吊组与各自对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表选项
形态学变化

光镜下观察,TS组和TS+R组骨小梁变薄变细,数量减少(表5),部分区域出现断裂甚至消失,骨髓腔面积增大,生长板变薄,而对照组骨小梁结构完整规则,呈网状结构,无明显缺损和破坏表现。统计各组骨小梁表面单位长度内成骨细胞,发现TS和TS+R组比各自对照组低47.76%和41.44%,两组下降程度间差异无统计学意义(P＞0.05);TS和TS+R组骨小梁内破骨细胞增多,分别较各自对照组上升30.06%和16.93%;甲苯胺蓝染色显示,TS和TS+R组生长板部位软骨细胞明显少于各自对照组;Masson染色显示TS组胶原纤维面积明显小于C1组(图3)。

表5 不同组小鼠骨小梁成骨细胞和破骨细胞计数 Table 5 Numbers of osteoblasts and osteoclasts inmice's trabecular bone among different groups
组别N.Ob/BS(1/μm)N.Oc/BS(1/μm)
C1组(n=4)16.56±4.34 3.16±0.33
TS组(n=4)) 8.65±1.31** 4.11±0.54**
C2组(n=4)15.83±3.67 3.13±0.27
TS+R组(n=4) 9.27±1.49** 3.66±0.38*
C1:尾悬吊14 d对照组;TS:尾悬吊14 d组; C2:尾悬吊14 d+休息后14 d对照组; R:休息14 d; N.Ob/BS:成骨细胞数; N.Oc/BS:破骨细胞数; 尾悬吊组与各自对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表选项

图3 不同组小鼠小梁骨形态学示意图(n=4,比例尺:100 μm) Fig.3 Morphological changes of mice's trabecular bone among different groups 第1行:成骨细胞形态(箭头,RANKL染色);第2行:破骨细胞形态(箭头,TRAP染色);第3行:生长板软骨细胞形态(箭头,甲基胺蓝染色);第4行:胶原纤维面积(箭头,masson染色)
图选项
讨 论

骨质疏松在各年龄段人群中均有发生,以往研究多集中于女性绝经后骨质疏松[16],近年来因废用性原因导致的青壮年男性骨质疏松的比例越来越高[13],建立一种快速、稳定的动物模型显得尤为迫切。小鼠在尾悬吊实验中运用不多,可能跟其体质量轻,运动能力强,易翻身咬断悬吊装置逃脱等原因有关[17]。

本研究在大鼠悬吊装置的基础上进行了改造,使之更加适合小鼠,并在造模前适应性饲养1周,发现悬吊14 d小鼠的一般状况良好,无明显的感染、脱毛、脱落或死亡,提高了造模成功率。

尾悬吊对肌肉等软组织的影响较大,短期内引起TS组和TS+R组小鼠体质量下降,但随着小鼠逐渐适应之后恢复很快,TS+R组体质量与其对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。相比而言,骨恢复较慢,本研究中TS组与TS+R组股骨长度之间的关系与Guo等[8]的研究一致。显微CT发现尾悬吊小鼠小梁骨ROI的BMD等多项空间结构指标显著下降,Tb.sp升高,三维重建发现骨小梁结构退化,由板状向杆状发展,悬吊移除并不能完全改善。而小鼠皮质骨ROI除TS组BMD低于C1组,其余指标组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。可见尾悬吊对小鼠小梁骨影响较大,而对皮质骨影响有限。生物力学检测主要研究骨受到外力后所产生的生物学效应,是对显微CT的重要补充[18]。本实验发现,TS组小鼠股骨最大载荷和弯曲弹性模量等指标降低明显,表明悬吊导致小鼠骨脆性增强,骨折的风险增大。但是随着悬吊的解除,TS+R组弯曲弹性模量等反映骨韧性的指标恢复迅速,骨韧性增强。此外,我们发现RANKL染色标记的成骨细胞在TS组和TS+R组明显低于各自对照组,且两组间差异无统计学意义(P＞0.05),表明尾悬吊可引起干骺端成骨细胞增殖活性显著下降,且短期内难以恢复。与之相对应的是,TRAP染色标记的破骨细胞在TS组和TS+R组高于各自对照组,表明尾悬吊同时具有激活破骨细胞的作用,但是随着悬吊解除,破骨细胞数较悬吊时有所下降。甲苯胺蓝染色进一步发现悬吊可导致小鼠生长板厚度变薄,软骨细胞数目较对照组下降。Masson染色发现TS组胶原纤维面积显著低于C1组,当悬吊解除14 d之后胶原纤维面积上升明显,表明悬吊是导致胶原纤维分解的重要原因。结合上述结果,本研究发现成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞以及胶原纤维的变化共同构成了骨质疏松的基础,尾悬吊在这个过程中发挥了抑制小梁骨重建的作用。

卵巢切除是目前最常用的一种骨质疏松动物模型,但其造模周期较长,一般2.5~3.0个月后股骨髁部BMD下降幅度为20％~30％[19],与其相比,本研究采用的方法14 d就能达到类似的骨质流失程度,且无手术创伤应激,造模时间短,避免了长期悬吊带来的动物伦理问题[20]。此外本研究还发现,将悬吊14 d的小鼠解除悬吊后14 d,小鼠股骨的大多数空间结构参数和生物力学指标并无明显变化,依然可以保持骨质疏松状态,有利于开展对骨质疏松治疗药物的研究。有文献发现雌性动物比雄性对悬吊更为敏感[21],因此该模型可以进一步推广到雌性小鼠。但本实验也存在一些不足,骨质疏松是一种代谢性疾病,缺乏代谢方面的指标,TS+R组的小鼠休息时间仅有14 d,时间较短,不利于对药物疗效的观察。总而言之,本研究通过尾悬吊法建立的C57雄性小鼠废用性骨质疏松模型,值得进一步推广运用。

参考文献
[1] Saxena R,Pan G,Dohm ED,et al. Modeled microgravity and hindlimb unloading sensitize osteoclast precursors to RANKL-mediated osteoclastogenesis[J]. J Bone Miner Metab,2011,29:111-122.
[2] Giangregorio L,Blimkie CJ. Skeletal adaptations to alterations in weight-bearing activity:a comparison of models of disuse osteoporosis[J]. Sports Med,2002,32:459-476.
[3] Lang TF,Leblanc AD,Evans HJ,et al. Adaptation of the proximal femur to skeletal reloading after long-duration spaceflight[J]. J Bone Miner Res,2006,21:1224-1230.
[4] Sun LW,Fan YB,Li DY,et al. Evaluation of the mechanical properties of rat bone under simulated microgravity using nanoindentation[J]. Acta Biomaterialia,2009,5:3506-3511.
[5] Morey ER,Sabelman EE,Turner RT,et al. A new rat model simulating some aspects of space flight[J]. Physiologist,1979,22:S23-24.
[6] Machwate M,Zerath E,Holy X,et al. Systemic administration of transforming growth factor-beta 2 prevents the impaired bone formation and osteopenia induced by unloading in rats[J]. J Clin Invest,1995,96:1245-1253.
[7] Keila S,Kelner A,Weinreb M. Systemic prostaglandin E2 increases cancellous bone formation and mass in aging rats and stimulates their bone marrow osteogenic capacity in vivo and in vitro[J]. J Endocrinol,2001,168:131-139.
[8] Guo BS,Cheung KK,Yeung SS,et al. Electrical stimulation influences satellite cell proliferation and apoptosis in unloading-induced muscle atrophy in mice[J]. PLoS One,2012,7:e30348.
[9] Martin EA,Ritman EL,Turner RT. Time course of epiphyseal growth plate fusion in rat tibiae[J]. Bone,2003,32:261-267.
[10] Judex S,Garman R,Squire M,et al. Genetically linked site-specificity of disuse osteoporosis[J]. J Bone Miner Res,2004,19:607-613.
[11] Sakai A,Nakamura T. Changes in trabecular bone turnover and bone marrow cell development in tail-suspended mice[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact,2001,1:387-392.
[12] Falcai MJ,Louzada MJ,de Paula FJ,et al. A modified technique of rat tail suspension for longer periods of observation[J]. Aviat Space Environ Med,2012,83:1176-1180.
[13] Lau RY,Guo X. A review on current osteoporosis research:with special focus on disuse bone loss[J]. J Osteoporos,2011,2011:293808.
[14] Cowles EA,Kovar JL,Curtis ET,et al. Near-infrared optical imaging for monitoring the regeneration of osteogenic tissue-engineered constructs[J]. Biores Open Access,2013,2:186-191.
[15] Jing D,Cai J,Wu Y,et al. Moderate-intensity rotating magnetic fields do not affect bone quality and bone remodeling in hindlimb suspended rats[J]. PLoS One,2014,9:e102956.
[16] Kang WB,Cong Y,Ru JY,et al. Osteoprotective effect of combination therapy of low-dose oestradiol with G15, a specific antagonist of GPR30/GPER in ovariectomy-induced osteoporotic rats[J]. Biosci Rep,2015,35:e00239.
[17] Oheim R,Beil FT,Barvencik F,et al. Large animal models of osteoporosis[J]. Osteologie,2011,20:41-49.
[18] Conti MI,Martinez MP,Olivera MI,et al. Biomechanical performance of diaphyseal shafts and bone tissue of femurs from hypothyroid rats[J]. Endocrine,2009,36:291-298.
[19] Shahnazari M,Wronski T,Chu V,et al. Early response of bone marrow osteoprogenitors to skeletal unloading and sclerostin antibody[J]. Calcif Tissue Int,2012,91:50-58.
[20] Ziambaras K,Civitelli R,Papavasiliou SS. Weightlessness and skeleton homeostasis[J]. Hormones:Athens,2005,4:18-27.
[21] Aguirre JI,Plotkin LI,Stewart SA,et al. Osteocyte apoptosis is induced by weightlessness in mice and precedes osteoclast recruitment and bone loss[J]. J Bone Miner Res,2006,21:605-615.
(收稿日期：2016-01-20)