内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一群具有增生和分化为血管内皮细胞潜能的干细胞，其促进血管再生作用是机体损伤修复不可缺少的^[1]。最近研究发现EPCs还具有分化为成骨细胞和造血细胞的能力^[2]。骨组织的新生血管具有转运循环细胞、氧气、营养物质和排泄代谢产物的作用，并且能够释放某些细胞因子维持骨组织生长和骨代谢稳态^{[3, 4]}，血管发生对新骨生成有调节作用，研究表明血管发生在骨折愈合过程中起重要作用^[5]。最近研究发现，长骨干骺端高表达CD31 和Emcn的毛细血管内皮细胞可促进血管发生和新骨生成，这种血管被称为“H”型血管，这种血管在骨质疏松症和高龄小鼠骨组织内明显减少，使血管发生和新骨生成偶联减弱，可能与增龄性骨丢失相关^{[6, 7]}。而目前对EPCs的研究多为动物实验，研究内容集中在EPCs与血管发生和新骨生成的分子机制及动力学机制，但人体EPCs的临床研究不多，对骨髓内皮祖细胞(bone marrow EPCs，BM-EPCs)研究报道也甚少。本研究通过11例股骨颈骨折和8例骨关节炎患者行人工髋关节置换手术来获取骨髓组织，密度梯度离心法从患者骨髓分离单个核细胞，流式细胞仪检测和鉴定骨髓内皮祖细胞数量，并且收集整理这19例患者的临床资料，包括年龄、身高、体质量、血常规、血液生化、血骨代谢指标和骨密度等结果，旨在研究比较脆性骨折患者和骨关节炎患者的骨髓内皮祖细胞数量，以及其他因素对老年人骨髓内皮祖细胞数量和分布的影响。

收集2014年9月至2015年4月复旦大学附属华东医院骨科收治的老年股骨颈脆性骨折和骨关节炎行全髋关节置换术患者40例，排除并发其他严重影响骨代谢的全身系统性疾病，如恶性肿瘤，肝、肾衰竭，甲状旁腺功能亢进，强直性脊柱炎，类风湿关节炎，肿瘤骨转移，排除服用影响骨代谢的药物，如双膦酸盐、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体调节剂 (selective estrogen receptor modulators，SERMs)等，骨关节炎的患者排除任一部位骨密度T-值≤-2.5者，最终19例纳入研究，其中股骨颈脆性骨折患者11例(男性7例，女性4例)，骨关节炎患者8例(男性5例，女性3例)，平均年龄为 (70.69±9.82)岁，平均体质量指数(body mass index，BMI)为 (24.32±3.70)kg/m²。19例患者入院次日清晨均空腹抽血行血常规、血液生化、血骨代谢等相关指标及骨密度检查，本临床研究方案已通过复旦大学附属华东医院伦理道德委员会审批(批件号20140037)，手术前谈话告知每位患者，所有入选患者均签署知情同意书。

11例股骨颈骨折患者均属脆性骨折，8例骨关节炎患者均因股骨头无菌性坏死行手术治疗，所有受试者均由同一名主刀医师在蛛网膜下腔麻醉下行人工髋关节置换术。取髋关节外侧切口，以股骨大粗隆为中心，切开皮肤及皮下组织，在股骨颈距小转子1 cm处定位后摆锯截骨，用箱型骨刀垂直于截骨平面，向长骨干骨髓腔方向凿出一方形松质骨块^[8]，将此标本立即置入含10%胎牛血清培养液中，用于骨髓内皮祖细胞的提取。

细胞分离和鉴定应用材料和试剂：PBS培养液(phosphate-buffered saline)，淋巴细胞分离液，1%胎牛血清，FITC(fluorescein isothiocyanate)标记的抗人CD34抗体，PE标记的抗人CD133抗体，PE标记的抗人KDR抗体。

主要仪器设备：密度梯度离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R,德国)，流式细胞仪(BeckmanFCL-500，美国)，全自动电化学发光免疫分析系统(美国罗氏公司E170)及其配套的E1ecsys试剂盒，双能X线骨密度仪(Hologic公司，美国)。

单个核细胞的分离：截骨平面处无菌条件下取一方形松质骨块标本放置入10%胎牛血清培养液中，用剪刀和血管钳剪碎，尽量使松质骨标本剪至粉末样颗粒，用吸管反复冲洗骨碎末，300目滤网过滤到离心管中，去除骨碎片和脂肪等，得到单细胞悬液，将细胞悬液小心加至等体积淋巴细胞分离液液面之上，密度梯度离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R，德国)20 ℃ 500 r/min离心35 min，可见液体分为4层，第1层为培养液；第2层呈云雾状，为白色单核细胞层；第3层为透明的淋巴细胞分离液；第4层为沉淀的红细胞。用吸管吸取单核细胞层至新的离心管，PBS稀释离心3000 r/min,5 min，重复2次，彻底洗去淋巴细胞分离液，收集到的细胞为单个核细胞^[9]。

流式细胞仪检测：取收集到的单个核细胞悬液加入PBS，将细胞数量调整到10⁶，分为两组，一组加入FITC标记的抗人CD34抗体(Diaclone)(1∶100)，PE标记的抗人CD133抗体(Miltenyi)(1∶100)，PE标记的抗人KDR抗体(Alexa Fluor)(1∶50)，另一组加入相同体积相同浓度的与单克隆抗体相同但未用免疫荧光标记的免疫球蛋白亚型做对比。暗室室温孵育30 min，置于流式细胞仪(Beckman FCL-500)检测3次，取平均值为检测值。

骨密度检测：研究对象进行双能X线骨密度检测(Hologic公司，美国)，仪器由参与专业培训的工作人员操作，每天按常规进行仪器质量控制，按常规骨密度检测方法，测定部位包括腰椎、股骨颈和髋部。仪器重复测定变异系数腰椎为1.0％，股骨颈为1.86％，髋部为0.95％。

血骨代谢生化标志物检测：所有研究对象均在晨7∶30至9∶30空腹采静脉血5 mL，l h内完成血清分离，当日检测。应用自动电子发光免疫仪(罗氏公司Cobas)检测血清25羟维生素D(25 hydroxy vitamin D,25OHD)、甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)等血生化指标。其中25OHD批内精度为5.4％~5.7％，批间精度为6.9％~9.9％：PTH批内精度为1.5％~2.7％，批间精度为3.0％~6.5％。

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，对患者的年龄、身高、体质量、BMI、血液生化指标、血骨代谢指标、骨密度等各项临床资料和骨髓内皮祖细胞的数量和分布进行统计学描述；采用t检验比较脆性骨折组和骨关节炎组骨髓内皮祖细胞的数量和分布及临床资料的统计学差异，用相关分析方法分析各个参数之间的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

所有受试者各临床资料基线见表1。受试者年龄为 (70.69±9.82)岁，体质量指数为(24.32±3.70) kg/m²。流式细胞仪检测显示，骨髓单核细胞中CD34⁺细胞数为(0.89±0.47)%，其中CD34⁺VEFR2⁺CD133^-占CD34⁺百分比为(60.04±13.22)%，CD34⁺VEFR2⁺CD133⁺占CD34⁺百分比为(10.44±2.78)%，CD34⁺VEFR2^-CD133^-占CD34⁺百分比为(27.85±5.80)%，CD34⁺CD133⁺VEFR2^-占CD34⁺百分比为(1.36±0.65)%。骨密度检测腰椎骨密度为(0.84±0.08)g/cm²，股骨颈骨密度为(0.68±0.21)g/cm²，全髋骨密度为(0.77±0.17)g/cm²，血25OHD水平(10.93±2.20)ng/mL。血脂、尿酸、钙磷水平和肾功能等基本正常。

两组之间的年龄和BMI比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与骨关节炎组相比，脆性骨折组的CD34⁺细胞数及CD34⁺VEFR2⁺CD133^-细胞数明显减少，差异具有统计学意义(P值分别为0.001和0.042)。与骨关节炎组相比，脆性骨折组的中性粒细胞数比值高，而淋巴细胞比值低，差异具有统计学意义(P值分别为0.004和0.014)。脆性骨折组血三酰甘油水平明显低于骨关节炎组(P=0.022)；脆性骨折组血PTH水平明显高于骨关节炎组，而血25OHD明显低于骨关节炎组，差异有统计学意义(P值分别为0.035和0.033)，两组腰椎骨密度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，而脆性骨折组的股骨颈和全髋骨密度均低于骨关节炎组，差异有统计学意义(P值分别为0.026和0.021)(表2)。

所有受试者各参数间的相关性分析显示，年龄与CD34⁺VEFR2⁺CD133^-的细胞数量之间存在显著性负相关，相关系数为-0.594，P值为0.015，年龄与股骨颈骨密度、全髋骨密度之间存在显著负相关，相关系数分别为-0.946，-0.945，P值分别为0.004，0.005；CD34⁺VEFR2⁺CD133^-的细胞数量与股骨颈骨密度和全髋骨密度呈显著性正相关，相关系数分别为0.847和0.925，P值分别为0.034和0.008；CD34⁺CD133⁺VEFR2^-的细胞数量与Ca离子浓度之间呈显著性负相关(r=0.523，P=0.038)；CD34⁺CD133⁺VEFR2⁺的细胞数量与全髋骨密度呈显著性负相关(r=-0.817，P=0.047)。血PTH水平与血25OHD水平呈显著性负相关(r=-0.999，P=0.028)(表3)。

骨组织是一个新陈代谢活跃的组织，它需要各种细胞如骨髓间充质干细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、造血干细胞等来维持源源不断地骨重塑过程。新骨形成在骨重塑和骨代谢的稳态过程中起到独一无二的作用，同样在骨折愈合过程也起到关键作用，而新骨形成在高龄患者或者骨质疏松症患者活性大大下降，导致骨量下降，脆性骨折风险增加^{[6, 9, 10]}。血管发生与新骨形成在骨重塑过程具有偶联作用，新生毛细血管不仅为新生骨组织建立了局部血流循环，带来氧气、营养物质、生长因子等促进骨生长的成分，还局部释放生长因子调节骨生成。Kusumbe等^[6]研究发现骨组织存在高表达CD31和Emcn的“H”型毛细血管，这些血管存在于长骨干骺端部位，可调节骨血管的生长并产生特殊新陈代谢骨血管微环境，维持骨前体细胞的活跃，最终偶联血管形成到新骨形成，而这类血管以及相关骨前体细胞的数量在老年哺乳动物及骨质疏松症模型骨组织内大大减少。所以，EPCs对骨重塑及新骨生成起到不可或缺的作用。

EPCs包含分化早期EPCs和晚期EPCs两个亚群，每个亚群的表面标志物不相同，早期EPC是属于不成熟的，表达造血干细胞标志CD133、CD34，进入分化的阶段后，造血干细胞标志消失，开始表达内皮细胞标志，如VE钙黏蛋白、vW因子、CD31和一氧化氮合酶^[11]。Hristov等^[12]发现骨髓或刚刚从骨髓迁移到外周循环中的EPCs为CD133⁺CD34⁺VEGFR2⁺，然而循环中EPCs为CD34⁺VEGFR2⁺CD31+VE-cadherin⁺，明显失去CD133，并开始表达vWF，这也证明循环EPCs含有上述两种亚群。目前研究显示，EPCs最经典的表面标志为CD34、CD133及VEGFR2^{[13, 14]}，CD34是Ⅰ型跨膜糖蛋白，表达于造血干细胞、造血祖细胞、胚胎纤维母细胞及血管内皮细胞表面^[15]。CD133是一种5次跨膜的细胞表面分子，表达于骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表面，是区分内皮祖细胞和成熟内皮细胞的主要指标^[16]。血管内皮生长因子受体2(varscular endothelial growth factor receptor,VEGFR-2)，又称血管内皮生长因子受体，是一种酪氨酸激酶受体，分布于成熟内皮细胞及内皮祖细胞表面。本研究将CD34⁺的细胞定义为总的EPCs，其中CD34⁺VEFR2⁺CD133^-的细胞定义为分化晚期EPCs，CD34⁺VEFR2⁺CD133⁺细胞定位为早期EPCs，属于刚刚获得分化潜能的内皮细胞，而CD34⁺VEFR2^-CD133⁺定义为原始EPCs，这类细胞不一定分化为血管内皮细胞，还可选择性分化为造血细胞。

人工髋关节置换手术时摆锯在股骨颈距小转子1 cm处平面截骨，暴露出截骨平面，用箱型骨刀垂直截骨平面向骨髓腔凿出的松质骨块与骨折处或骨坏死处相距较远，可以认为分离获取的骨髓标本来源于正常骨组织，与骨折或骨关节炎无直接关系。本研究在患者入组时骨关节炎组排除了任一部位骨密度≤-2.5的患者，所以脆性骨折组确诊为严重骨质疏松，而骨关节炎组是没有骨质疏松的老年人群。试验结果提示，脆性骨折组骨密度明显低于骨关节炎组，而两组患者在年龄、BMI等方面比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，这提示与骨关节炎组相比，脆性骨折组老年人骨量丢失更为显著，骨质量下降更为严重。而脆性骨折组的骨髓EPCs总数和分化成熟的EPCs数量明显低于骨关节炎组，这一结果说明与骨量相对较高的老年人相比，骨量丢失严重的老年人骨髓内皮祖细胞数量明显减少，发育成熟障碍，而EPCs具有分化为血管内皮细胞和成骨细胞的潜能，对血管新生和新骨形成都起到重要调节作用^[2]。

外周血各种细胞的检测比较显示，与骨关节炎组相比，脆性骨折组中性粒细胞数明显增高，而淋巴细胞数明显降低，这可能因为脆性骨折组的患者骨折入院，处于急性病程期，机体因骨折引起骨组织损伤、血管破坏向循环释放炎性因子引起一过性的炎性反应，而骨关节炎组的患者择期入院，属于慢性病程，无上述的急性炎症应激过程。

Fisher等^[17]对761例老年髋部骨折患者进行研究，发现股骨粗隆间骨折中维生素D缺乏症占82.1％，在股骨颈骨折中占77.8％，在本研究中，脆性骨折组和骨关节炎组血PTH和25OHD差异具有统计学意义(P＜0.05)，脆性骨折组血PTH水平明显高于骨关节炎组，而血25OHD水平明显低于骨关节炎组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。世界卫生组织(WHO)推荐为了维持骨健康，血25OHD浓度应大于30 ng/mL，而脆性骨折组的血25OHD远远低于该值，这可能与EPCs数量减少有关，但具体机制还有待于研究。该研究骨密度检查结果中，无论是腰椎骨密度(L_1-4)，股骨颈骨密度(femur neck，FN)，还是全髋骨密度(total hip)，脆性骨折组均低于骨关节炎组，并且在股骨颈和全髋的差异具有统计学意义(P＜0.05)，而腰椎的骨密度受到老年人腰椎退变和腹主动脉钙化的影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。

从19例患者的各项指标之间的相关分析中，可以看出年龄与CD34⁺VEFR2⁺CD133^-细胞数及髋部骨密度之间都存在负相关关系，差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示EPCs的数量特别是分化成熟EPCs会随着年龄越大而减少，成熟分化障碍，而EPCs具有分化成血管内皮细胞的潜力，对于血管发生和新骨形成具有关键作用，与Kusumbe等^[6]研究结论即在高龄哺乳动物骨组织内这种“H”型血管的数量较年幼动物大大减少相符合。同时年龄与总的EPCs细胞数间也存在负相关关系，但差异无统计学意义(P＞0.05)，可能与本实验样本量较少有关。在相关分析中，还发现CD34⁺VEFR2⁺CD133^-的分化成熟EPCs数量与股骨颈和全髋骨密度之间具有显著正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)，这也证明分化晚期EPCs作为血管内皮细胞的前体细胞对于血管形成发挥作用，同时还可能通过旁分泌途径释放细胞因子促进成骨细胞生长和增生进而增加骨形成提高骨密度。

至目前为止，对于EPCs的研究主要停留在动物模型阶段，对于人体EPCs的研究较少，主要是因为获得人EPCs的途径较少，只能通过新生流产儿、人工髋关节置换手术、24 h内死亡的尸体解剖等途径获得。动物模型实验中基本已经确定 EPCs具有分化形成血管内皮细胞和成骨细胞的潜能，并且具有快速增生的能力，对于机体新骨发生具有重要意义，但这一作用在人体研究中还未得到证实，本研究通过比较老年人脆性骨折组和骨关节炎组的骨髓EPCs数量和分布并观察EPCs与骨量之间的相关性，证实了老年人年龄与骨髓EPCs和骨量间的负相关关系，对今后人骨髓EPCs的深入研究提供了研究方法和理论依据，但本研究所取样本量较少，研究成果和结论仅作为后期研究的参考依据，待后期扩大样本量，以及通过部分体外试验进一步验证骨髓EPCs对于骨形成和骨代谢的作用。