骨质疏松症是一种以骨密度、骨强度降低为主，同时骨量减少并伴随单位体积内骨微结构进行性退变的常见骨病[1-2]，可增加患者骨折的风险及发生率。随着我国老年化的进程，骨质疏松已成为现今的社会问题，造成了巨大的经济负担，严重影响老年人的生活质量及生命预期。目前临床治疗骨质疏松的一线用药主要为抗骨吸收类药，包括双膦酸盐、选择性雌激素受体激动剂、雌激素替代药物以及抑制核因子kB受体活化因子配体 (receptor activator of NF-KB ligand，RANKL) 的特异性抗体denosumab (迪诺赛麦)[3-5]。这些抗骨吸收药物虽然能够部分减少破骨细胞的数量与活性、促进骨密度的提升，进而减少骨破坏的程度，但无法修复及改善已受损的骨微结构[6]。对于降低骨折风险以及骨微结构的改善，骨形成活动显得更为重要。而目前促骨形成的药物临床上应用较少，特立帕肽作为目前临床唯一应用的促骨形成药物[7]，通过增加成骨细胞的活动与数量，促进成骨细胞分化，进而升高骨密度及骨量，改善骨微结构。相较于抗吸收剂，其通过影响骨的微结构，增加骨量、提高骨强度的效果更加直接[8]。但同抗骨吸收药物相比，特立帕肽需每日皮下注射，并且费用较高，同时具有潜在的骨肉瘤发病风险，在临床使用上受到诸多限制[9]。目前，针对骨硬化蛋白 (sclerostin) 的单克隆抗体，在促骨形成方面的良好治疗效果得到越来越多研究者与临床医生的重视，通过特异性抑制骨硬化蛋白，促进成骨细胞分化及表达，在不同类型研究中的效果均表现优异，成为近年来备受关注的热点。本文对骨硬化蛋白在骨质疏松骨代谢发病机制中的作用以及骨硬化蛋白单克隆抗体治疗骨质疏松的基础及临床前期研究进展做一综述。
骨硬化蛋白骨硬化蛋白是由人类基因组17q12-21染色体中的硬化性骨化病 (sclerosteosis，SOST) 基因编码的糖蛋白，主要表达于成熟的骨细胞中，是骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP) 的抑制因子，对骨形成活动起抑制作用[10-11]。SOST基因含有两个外显子和一个内含子，其中两个外显子共同编码骨硬化蛋白。骨硬化蛋白由213个氨基酸序列组成，相对分子质量为24 000[12]。SOST基因是人们在对骨硬化病 (sclerosteosis) 和van Buchem病两种高骨量遗传性疾病的研究中发现[13-14]。骨硬化病是一种罕见的常染色体隐性疾病，特征是骨进行型增生和硬化，以颅面骨为著，可造成面部神经麻痹以及颅内压增高等症状。由于SOST基因的突变造成骨硬化蛋白表达减低或无表达，导致骨形成活动过度增加[15]。Van Buchem病是一种常染色体隐性疾病，症状与骨硬化病类似，但多无高大身材与并指等症状出现，多出现于荷兰，其原因是由于SOST基因下游35 kb处出现了52 kb长片段的缺失[16]，而缺失的片段中包含调节骨硬化蛋白表达的增强子，缺失该片段导致骨组织中的骨硬化蛋白表达下降。
SOST mRNA的表达具有高度的组织特异性。在胚胎形成时期，SOST mRNA表达于一些非骨骼组织中，如肾脏、心脏和肝脏，而在发育成熟的人类与小鼠体内，SOST mRNA与骨硬化蛋白特异性表达于骨与关节组织中[17]。骨硬化蛋白的分泌与激素作用 (如甲状腺素、降钙素、糖皮质激素、性激素等) 和机械负荷息息相关。在对原发性甲状旁腺功能亢进患者的研究显示，血清骨硬化蛋白水平较甲状旁腺功能正常人群以及甲状旁腺功能亢进术后甲状旁腺素恢复正常者要显著降低[18]。绝经后女性血液检测显示，雌激素的缺乏导致血清骨硬化蛋白的含量水平增加；而给予绝经后女性相应雌激素替代治疗后，血清骨硬化蛋白水平则明显下降[19]。
小鼠体内研究表明，甲状旁腺素抑制了骨细胞中骨硬化蛋白的分泌[20]，而糖皮质激素可增加骨硬化蛋白的分泌[21]。在对小鼠体内骨硬化蛋白与机械负荷关系的研究中发现，骨骼肌的负荷或拉伸活动可以减少骨骼组织中骨硬化蛋白的表达，而人为减少机械负荷与肌肉拉伸活动增加了血清骨硬化蛋白的水平[22]。在小鼠体外研究中发现，向培养的小鼠成骨细胞中加入骨硬化蛋白可抑制成骨细胞的增生和分化，同时促进了成骨细胞的凋亡[10, 23]。相似的结果出现在SOST基因过表达的小鼠体内，骨密度与骨强度明显地降低，成骨细胞活性大大降低，骨形成活动明显减少[24]。而SOST基因敲除小鼠的成骨细胞增生与分化情况明显增多，骨密度得到了显著提升，通过micro-CT检测可以发现骨小梁密度与骨皮质厚度有着显著增加，骨微结构得到改善，同时血清中的骨形成标志物 (如骨钙素) 明显升高[25]。
骨硬化蛋白与Wnt通路的作用机制现有研究表明，骨硬化蛋白主要通过抑制Wnt/β-链蛋白经典信号通路来抑制骨形成活动[26]，而Wnt信号通路在骨组织形成与再生的过程中起到了重要的调节作用[27]。Wnt信号通路包括经典的Wnt/β-链蛋白信号通路和非经典的Wnt信号通路 (钙离子依赖型通路和平面细胞极化通路)[28]。在经典的信号通路中，Wnt家族蛋白通过与成骨细胞膜上的跨膜卷曲蛋白 (Frizzled) 以及低密度脂蛋白相关受体5和 (或)6 (low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP5/6) 结合，进而磷酸化细胞内的Dishevelled蛋白 (Dsh)，磷酸化的Dsh使下游的蛋白质糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β) 磷酸化，阻断GSK-3β降解β-链蛋白。当细胞质内的β-链蛋白积聚到一定浓度后，β-链蛋白可转入细胞核内，与Tcf/Lcf转录因子相结合，促进成骨细胞增生与分化的相关基因 (如WISP1和RUNX2) 表达[29-31]。骨硬化蛋白作用于成骨细胞细胞膜上的LRP5/6蛋白，通过与LRP5/6蛋白结合，竞争性抑制了正常Wnt蛋白与LRP5/6的结合，使Wnt信号通路的传导被阻断，使GSK-3β能够降解细胞质中的β-链蛋白，转入细胞核与Tcf/Lcf结合的β-链蛋白减少，WISP1和RUNX2表达降低，从而影响了成骨细胞增生与分化，骨形成活动受阻[32]。
有研究表明Wnt通路表达升高可间接地抑制破骨细胞的增生与分化活动，减少骨吸收的活动。主要的机制是Wnt通路的表达可促进骨保护素 (osteoprotegerin，OPG) 的分泌，而骨保护素能够抑制破骨细胞的活性，同时骨保护素可抑制骨细胞中的RANKL的表达，而RANKL正是促进破骨细胞分化的重要因子[33]。更多的研究表明，骨硬化蛋白不但可与LRP5/6蛋白结合，同时也与低密度脂蛋白相关受体家族其他蛋白相结合，如LRP4蛋白被证实通过与骨硬化蛋白的结合抑制Wnt通路的表达[30-31]。另外，骨硬化蛋白可活化MAPK信号通路[34]，进一步诱导破骨细胞的分化，促进骨吸收活动。骨硬化蛋白与酪氨酸蛋白激酶erbB-3间存在相互作用，调节成骨细胞中erbB-3参与的相关信号通路[35]，但相关机制尚待深入研究。
骨硬化蛋白单克隆抗体的相关基础研究绝经后骨质疏松为最常见的原发性骨质疏松病因之一。Li等[36]将6个月大的成熟雌性大鼠去卵巢后，无激素替代治疗喂养1年，成功造出绝经后骨质疏松大鼠模型。而后将模型鼠分为3组，分别给予骨硬化蛋白单克隆抗体，甲状旁腺素与安慰剂。结果显示骨硬化蛋白单克隆治疗组显示出更强的骨形成能力，在骨膜表面、皮质骨外层以及骨皮质内都有显著地成骨活动。同时，经过骨硬化蛋白单克隆抗体 (Scl-Ab) 治疗后的绝经后骨质疏松模型大鼠的骨密度，比对照组的正常成熟雌性大鼠的骨密度还要高。相似的结果出现在一项以睾酮水平正常的雄性大鼠为模型的实验中，给予实验组大鼠不同剂量的Scl-Ab (5或25 mg/kg) 每周两次，干预5周后进行骨密度检测，显示腰椎1-5和四肢长骨的骨密度明显高于安慰剂组，micro-CT检查显示腰椎5、股骨干、股骨颈等处的骨小梁、皮质骨较对照组明显增厚[37]。
在一项对雌激素水平正常的雌性长尾猕猴的实验中，给予实验组注射Scl-Ab，按照不同剂量分亚组 (3，10，30 mg/kg)，每月皮下注射1次，为期两个月后，检测长尾猕猴各部位骨密度以及相关指标[38]。测量结果显示Scl-Ab治疗有显著促进骨形成的能力，并与治疗剂量呈正相关。与安慰剂组比较，在股骨颈、桡骨干骺端、胫骨干骺端等部位，骨密度明显增加，达11%~29%[38]。
在肉毒杆菌致瘫小鼠模型的实验中，致瘫组分为2组，分别为给予Scl-Ab与0.9%氯化钠注射液，未致瘫对照组给予等同剂量的Scl-Ab与0.9%氯化钠注射液，而后向4组小鼠骨骼中植入螺钉测定拉力值，结果显示致瘫组未应用Scl-Ab小鼠的骨抗拉力值降低，应用Scl-Ab后骨抗拉力值升高[39]，反映Scl-Ab有促进骨折初期愈合的治疗潜力。在一项幼年大鼠股骨缺损骨折模型的实验中[40]，实验组分为骨折缺损造模后立即给予Scl-Ab治疗组与骨折缺损造模两周后开始Scl-Ab治疗组，两组分别干预10周后测量相关指标，结果显示骨折后早期Scl-Ab干预骨密度增高程度与骨痂形成速度比骨折两周后开始Scl-Ab干预的效果更加显著；与安慰剂组相比，Scl-Ab治疗加快骨折愈合速度，骨折部位的骨骼强度高于安慰剂对照组。在另一项长尾猕猴单侧腓骨部分切除骨折模型中，给予Scl-Ab治疗后骨折部位的骨强度明显提升，骨折间隙嵌入的纤维组织有所减少，骨折不愈合率较对照组明显降低[41]。
结合以上基础研究，Scl-Ab可为原发性骨质疏松以及骨折术后愈合不良的患者提供了新的治疗方法。
骨硬化蛋白单克隆抗体临床前研究进展骨硬化蛋白单克隆抗体临床前期研究现已经完成了临床Ⅰ期与Ⅱ期的工作，Ⅲ期研究正在进行中。Romosozumab (又称AMG 785，美国Agmen公司) 是第1个应用于人体体内的骨硬化蛋白单克隆抗体。在临床Ⅰ期的随机、双盲、安慰剂对照研究中，共有72名健康男性与绝经后女性纳入实验，分别给予Romosozumab和安慰剂，其中皮下注射Romosozumab组的剂量分别为0.1、0.3、1、3、5、10 mg/kg，静脉注射组的剂量为1，5 mg/kg，给予干预85 d后测量相关数据[42]。药物动力学显示约皮下注射1周后Romosozumab达到药物浓度峰值。骨形成与骨吸收血清标志物检测显示，骨形成相关指标与用药浓度呈正相关，在Scl-Ab 10 mg/kg皮下注射的受试者体内，1型前胶原氨基末端肽 (procollagen 1 N-terminal peptide，P1NP)、骨特异性碱性磷酸酶 (bone specific alkaline phosphatase，BSAP)、骨钙素分别升高了184%、126%、176%，而在5 mg/kg皮下注射的实验者体内分别提高了167%、125%、143%。骨吸收指标血清C端交联肽 (cross linked c telopeptide，sCTX) 在Scl-Ab 10 mg/kg与5 mg/kg皮下注射治疗组则分别下降了54%与49%。测量的骨密度值与Scl-Ab注射浓度也呈正相关，干预85 d后测量腰椎骨密度，10 mg/kg与5 mg/kg皮下注射治疗组分别提升了5.3%与5.2%，而股骨颈密度则改善了2.8%与1.1%。相关不良反应则发生了1例，于10 mg/kg Romosozumab皮下注射组中发生1例重症非特异性肝炎，用药1 d后肝酶达到正常水平上限的13倍，停药第8天复查腹部B超未见明显异常，第26天肝功恢复正常[42]。现暂无确凿证据证明肝酶升高与骨硬化蛋白单克隆抗体应用有关。
Romosozumab临床Ⅱ期的随机、双盲、安慰剂、多中心对照研究纳入了419名骨密度较低的绝经后妇女，实验组分别给予Romosozumab 70、140、210 mg每月皮下注射和Romosozumab 140、210 mg每3个月皮下注射；对照组分为安慰剂组、每日注射特立帕肽20 mg组和每周口服阿仑膦酸钠70 mg组。与安慰剂组相比，Romosozumab治疗组干预12个月后腰椎、股骨颈处的骨密度有较大提升，改善程度最大的是210 mg每月皮下注射治疗组，腰椎骨密度提升了11.3%，股骨颈密度提升了3.7%，但桡骨远端的骨密度却未见明显改变。Romosozumab治疗组的骨密度提升程度较特立帕肽和阿仑膦酸钠治疗组都要高。而有关骨代谢指标显示，Romosozumab治疗组中的P1NP、BSAP、骨钙素等代表骨形成的指标，在治疗后1周左右升高速度显著，于治疗后1个月达到峰值，此后逐步回落至正常值。而骨吸收指标sCTX在治疗后1周达到最低值，而后维持在正常值之下[43]。
目前共有5项关于Romosozumab的临床Ⅲ期实验正在进行中，其中4个是治疗绝经后女性骨质疏松的相关研究，另外一个则是关于男性骨质疏松方面的治疗研究[26]。与此同时，另一种用于临床前期实验的骨硬化蛋白单克隆抗体Blosozumab (Eli Lily，美国) 现已完成了相关临床Ⅰ期与Ⅱ期实验。在Ⅰ期临床实验中，针对绝经后女性给予Blosozumab抗骨质疏松治疗后，骨形成与骨吸收指标均明显改善，腰椎骨密度提高了3.41%[44]。而在Ⅱ期临床实验中，120名绝经后骨密度较低妇女接受了Blosozumab皮下注射治疗，12个月后腰椎与髋部骨密度分别提高了17.7%和6.2%[45]。
骨硬化蛋白单克隆抗体可能存在的并发症和未来应用展望基于骨硬化蛋白单克隆抗体的应用原理，使用Scl-Ab后可能产生同骨硬化病和van Buchem病类似的症状，如颅面部骨骼增生所导致的颅神经受压，脊柱椎管狭窄症，或者椎间孔增生导致的周围神经受压等症状。另外，在临床前期实验中发现，应用骨硬化蛋白单克隆抗体后，受试者体内的血清钙有轻度降低的情况发生，而后血清中甲状旁腺素代偿性升高，血清钙随之回到正常值。这种反应对于无相关基础疾病的患者风险较低，但对于维生素D缺乏症或罹患肾脏疾病的患者则存在着一定风险。同时对于免疫系统紊乱的患者，身体内注入外源性抗体可能会进一步加重免疫反应，一方面可能会影响Scl-Ab的药物动力学或增加药物毒性，另一方面可能刺激机体产生针对Scl-Ab的相关抗体，使药物疗效降低。虽然这些在临床前期实验中均未有提及，但需要在之后的研究中进一步深入探讨。最后诱发骨肉瘤是所有促骨形成类抗骨质疏松药物共同的潜在风险，在Scl-Ab现有的临床前期实验中并未出现该类情况，同时在唯一一种经过美国食品和药物管理局 (Food and Drug Administration，FDA) 批准上市的促骨形成类抗骨质疏松药物特立帕肽的临床应用中，截止到目前暂无骨肉瘤发病率升高的临床报道[46]。但在对人体骨肉瘤细胞的培养研究中发现，Wnt通路存在着被异常激活的情况[47]，同时Wnt通路被异常激活也和结肠肿瘤和肝癌的发生存在着联系[48]。
尽管存在着以上的各种风险，但骨硬化蛋白单克隆抗体治疗骨质疏松的临床前期实验带来了新的希望，有效的骨密度改善率与较低的并发症发生率让我们有动力去挖掘骨硬化蛋白单克隆抗体背后存在的治疗潜力，更加深入地去研究骨硬化蛋白单克隆抗体在人类体内的药物动力学与最佳治疗方案的制定。
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| (收稿日期：2016-07-05) |