2. 200241 上海，华东师范大学“青少年健康评价与运动干预”教育部重点实验室
2. Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention of Ministry of Education, School of Physical Education and Health, East China Normal University, Shanghai 200241, China
骨骼的形成一般分为膜内成骨和软骨内成骨两种，人体身高增长主要是通过中轴骨、四肢骨的软骨内成骨实现。在运动中，骨骼主要起杠杆作用，保护重要身体器官。运动具有调节骨生长的作用，科学的体育运动可以促进青少年骨骼的健康发育，改善骨骼参数[1]。已有研究表明，运动可促进大鼠生长板增殖层的肥大，促进骨的纵向生长[2-5]，运动作为调节骨生长的重要方式，其调控骨生长的软骨内成骨的分子生物学机制，本文根据近年来研究成果进行综述。
软骨内成骨的基本模式骨骼的形成起始于间充质干细胞(bone marrow stem cells，MSC)凝集，此后MSC分化成软骨细胞，这些软骨细胞分泌富含Ⅱ型胶原蛋白(collagen，type Ⅱ，Col2)和聚集蛋白聚糖(cartilage-specific proteoglycan core protein，Aggrecan)的软骨细胞外基质，同时表达SRY相关高迁移率族9(SRY-related HMG box 9，Sox9)和其他一些转录因子，凝集在软骨边缘的软骨细胞形成软骨膜。软骨通过软骨细胞的增生、基质合成和肥大实现增长。肥大的软骨细胞高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其他因子，诱导血管形成和侵入，吸引和破骨细胞密切相关的巨噬细胞系，然后消化和矿化软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，与软骨细胞紧挨着的软骨膜细胞直接分化为成骨细胞，分泌类质骨基质形成骨领，最终形成皮质骨。肥大软骨细胞发生细胞凋亡，剩下的软骨基质为入侵的血管携带进来的成骨细胞提供一个支架，形成松质骨。在四肢骨长骨的纵向生长中，于初级骨化中心和次级骨化中心之间形成软骨细胞板称为生长板；生长板的软骨细胞不断增生和肥大，实现骨的纵向生长。成年后，初级和次级骨化中心融合，生长板消失[6]。
生长期小鼠，近端胫骨的纵向生长，9%源于生长板软骨细胞的增生，32%源于基质合成，59%源于生长板软骨细胞的肥大。软骨细胞肥大化后，骨纵向长轴方向直径较增生状态增加了4倍，体积较增生状态增大了10倍，因此，生长板肥大层软骨细胞的肥大是骨骼纵向生长的主要推动力[7]。运动如何调控生长板软骨细胞的肥大来调控骨骼的纵向生长一直是运动与骨代谢领域研究的热点。
运动调节生长板纵向长骨的因素生长板是骨纵向生长的最终靶器官。运动可通过许多激素如生长激素、性激素、糖皮质激素等影响生长板的生长过程，此外，还有许多局部调节因子如，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、印第安刺猬样蛋白Ihh(Indian hedgehog，Ihh)、甲状旁腺素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)、激活骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)/转化生长因子β (transforming growth factor β，TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和VEGF等也参与调节生长板软骨细胞增生与分化[8]。
调节软骨内成骨的细胞因子转录因子：Sox9属于转录因子SOX家族，在MSC前体细胞阶段已开始表达，在软骨细胞的增生分化阶段高表达，在软骨内成骨过程中起着非常重要作用。如果人类Sox9基因突变，会导致严重的骨骼畸形，软骨标记性基因，如Col2a1编码Col2受Sox9调控表达。同时两个Sox家族成员Sox5、Sox6，协助Sox9激活ECM的相关特异性因子[9]。其他转录因子在维持早期软骨细胞的增生能力方面必不可少，如CREB/ATF，C-Fos，AP1家族的成员[10]。软骨细胞的成熟肥大化伴随着Sox蛋白表达或活性的降低。除了Sox9蛋白的降低外，还有其他转录因子，如Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)、Runx3，它们的表达会促使软骨细胞肥大化[11]。小鼠缺乏Runx2和Runx3，将阻碍软骨细胞肥大成熟。Ihh、Coll0a1编码Col10及基质金属蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP13)基因可被Runx2直接结合并激活导致软骨细胞肥大[12]。有研究发现，3周运动后大鼠椎间盘Sox9蛋白表达增加[13]，4周跑台运动生长板Sox9的表达降低[5]。
可溶性介质：Ihh通过PTHrP负反馈维持软骨细胞增生抑制肥大，使软骨细胞增生和肥大保持在一个正常动态平衡的范围之内。研究发现，Ihh可单独调控软骨细胞的增生及肥大成熟，也可刺激长骨末端软骨膜细胞中PTHrP的表达，从而抑制生长板中软骨细胞肥大，维持其增生状态[14]。也有研究者认为，激活骨形成BMP和Wnt信号通路与Ihh/PTHrP调控软骨细胞肥大化[15]。研究还发现，FGFs/FGFRs在软骨内成骨的过程中非常重要，人类FGFR3基因突变后，将引起严重的软骨发育不良和侏儒症[16]。在FGF9基因敲除小鼠研究中发现，其调节早期软骨细胞的肥大化和骨骼中血管的形成，而且发现FGF18在软骨形成过程中扮演着十分重要的角色[17]。FGFrl主要在预肥大软骨细胞和肥大软骨细胞中表达，而FGFr3主要在MSC聚集和软骨细胞增生中表达并起负调节作用。也有研究发现，一部分FGFr3通过软骨信号通路直接调控软骨形成，另一部分通过Ihh/PTHrP/BMP信号通路间接激活下游的如STAT1和ERK信号通路导致软骨发育不良。研究发现，抗阻运动降低老年小鼠FGF-2的表达[18]。
其他生长因子如TGF-β、甲状腺素(thyroid hormone，TH)、IGFs和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)也能调控软骨内成骨过程[19]。有研究发现，运动可通过局部因素如IGF-I、VEGF、RANKL和骨钙素促进肥大软骨细胞的成熟和软骨内骨化，跑台运动结合短期GH治疗，会对生长迟缓慢性肾病大鼠软骨内骨化和小梁骨形成产生强烈的协同作用[3, 5]。
ECM：随着软骨细胞的不断成熟，软骨细胞产生大量的ECM，而ECM在软骨内成骨过程中发挥着重要的作用。在整合素的作用下，ECM和其他细胞表面蛋白结合形成黏着斑复合物，将信号从ECM传递到软骨细胞内[20]。软骨细胞特异性敲除整合素小鼠发现了生长板软骨细胞黏附作用减弱，增生软骨细胞排列杂乱无序，同时形状发生变化。在这些敲除小鼠中，软骨细胞特异性基因Col2a1的表达与野生型相仿，但软骨细胞的增生减少[21]。
ECM蛋白通过绑定连接、存储和释放可溶性因子，再结合整合素和其他细胞外基质受体为软骨细胞提供信号从而调节软骨的形成。研究表明，软骨内成骨受可溶性介质和ECM本身之间信号传递相互作用的调控。多分子复合物黏着斑蛋白，通过在细胞外微环境的黏附作用或整合素和钙黏素实现在细胞之间信号传递，在软骨形成和软骨内成骨过程中发挥作用。有研究发现，在软骨细胞培养和跖骨器官移植中，因黏着斑蛋白功能受损，从而导致Col2al、aggrecan、Col10al和Runx2基因表达降低。黏着斑蛋白功能的受损，可通过IGF-I抑制Col2al和蛋白聚糖的表达上调，阻碍软骨增长[22]。这些结果表明，运动可能调节软骨细胞特异性基因的表达是黏着斑蛋白通过整合ECM及可溶性因子如IGF-1信号实现。
表观遗传学及非编码RNA：越来越多的研究证明，软骨内成骨中，表观遗传及LncRNA、microRNA介导机制发挥的作用不容小觑[23]。研究发现，在组蛋白去乙酰酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors，HDACs)：HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC7中，HDAC1和HDAC2具有抑制软骨标记性基因如Col2al表达的作用，HDAC4对Runx2的活性具有抑制，可抑制软骨细胞过早过快的肥大，同时还发现，HDAC7的表达可促进MMP13的表达，对生长板软骨细胞最后的成熟、成骨阶段非常有利[24]。研究还发现，通过转录因子HIF-2a和CREB甲基化CpG特定位点，能使MMP13的激活受抑制[25]。过表达DANCR可抑制GSK-β和β-catenin，Sox4通过LncRNA DANCR通过Wnt/β-catenin参与MSCs向软骨细胞分化和增生[26]。DANCR除Sox4结合位点外还有STAT-3结合位点，通过Trps1调节D1和Bcl-2来调控软骨细胞的增生和成熟[27]。在人类软骨细胞中，长链非编码RNA-UCA1通过抑制miR-204-5p促进MMP-13表达[28]。lncRNA Gas5能够通过miRNA-21调控FGF1的表达，从而调节生长板软骨细胞增生和凋亡[29]。
生长板软骨细胞在不同的成熟阶段产生不同基质小泡(matrix vesicle，MVS)，不同的MVS有不同miRNA，不同的miRNA在软骨细胞分化过程中发挥着不同的作用。小鼠缺乏miRNA-140有轻度的身材矮小表型。miRNA-199a能调控BMP从而调控Smadl，最终调节软骨形成。miRNA-145可通过调节Sox9从而调节MSC向软骨细胞分化[30]。运动如何调控非编码RNA调控生长板软骨内成骨，有待进一步研究。
调节生长板生长的信号通路Ihh/PTHrP信号通路：在哺乳动物中Ihh参与软骨内骨化。当条件性敲除Ihh，会导致软骨细胞膜合成PTHrP降低，增加骨骺端软骨细胞肥大化[31]。PTHrP由骨骺端的软骨膜软骨细胞表达，作用于生长板增生层的软骨细胞，使增生层的软骨细胞保持增生状态。随着增生层软骨细胞的不断增长，增生层的软骨细胞距离分泌PTHrP的软骨膜端越来越远，其作用也会逐渐减弱，则软骨细胞进而转向肥大分化而停止增生，并且肥大的软骨细胞表达Ihh，而Ihh又促进骨骺端的软骨膜软骨细胞表达PTHrP来抑制肥大，不至于过度肥大，这就形成了Ihh/PTHrP的负反馈循环[32]。PTHrP是甲状旁腺素家族成员，抑制Runx2的表达。生长板Sox9是PTHrP一个靶基因，通过增加Sox9基因活性可介导PTHrP信号维持细胞的非肥大化[33]。Ihh是软骨内成骨重要的因子，敲除Ihh，小鼠软骨细胞增生和肥大显著减少，干骺端骨矿化密度降低和骨小梁形成缺失[34]。有研究表明，Ihh可通过下游的转录因子家族的成员GLI1/2利用Runx2/Smad相互作用正向调节Col10的表达。长骨的末端的静息软骨细胞在分泌PTHrP，随后抑制增生层和肥大层Ihh的生产，软骨细胞肥大，旁分泌产Ihh[35]。骨骼的作用使支撑机体，承受压力，力的作用为生长板内的细胞间液体流动提供了动力。研究发现，适当的压力或拉力能促使PTHrP的表达上调，且运动的力学刺激显著增加PTH水平，在骨小梁和皮质骨形成中起着关键作用，能善皮质骨的形成提高骨的力学性能[36]。罗冬梅研究发现，运动可通过调控PTHrP表达来调节生长板软骨细胞的活动。运动的力学刺激可能通过促进Ihh/PTHrP通路来调节生长板软骨内成骨，进而调控骨的纵向生长[4]。
Wnt信号通路：Wnt主要包括经典信号通路Wnt/β-catenin和非经典的Wnt/PCP、Wnt/Ca2+等信号通路。Wnt/β-catenin信号通路在骨量和软骨内成骨中发挥着十分重要的作用：一个调控胚胎时期间充质干细胞分化到软骨细胞，另一个调控出生后软骨细胞肥大化，一直持续到青春期结束，不同的Wnt及其下游组件在这两个阶段中起的调控作用不同[37]。在机体生长期，运动刺激生长板软骨细胞的适应性肥大进而促进软骨内成骨增加，骨的纵向生长增加，所以科学的运动在这个阶段对身高增加显得很重要。
经典的Wnt信号通路的核心组件β-catenin调控了软骨细胞的成熟和肥大化过程，促进了软骨基质的矿化和松质骨形成。当敲除核心组件β-catenin后，软骨肥大化、成熟和矿化整个过程都受到了抑制。β-catenin可激活下游软骨细胞Runx2和Ihh信号通路，促进软骨细胞成熟的Marker蛋白Col10的表达[38]。β-catenin还可能通过IGF-1信号通路和PTHrP信号通路发挥调控软骨内成骨，从而调控长骨纵向生长的作用[39]。许多研究揭示了Wnt信号通路在维持软骨内成骨稳态中的核心作用，中等活性的Wnt信号促进软骨细胞增生，但随着活性进一步增大会增加软骨细胞肥大表达MMP13[40]。许多研究表明，软骨细胞肥大Sox9和Runx2是开关，Wnt信号和多种配体，可调控这个开关。不同的Wnt蛋白在软骨细胞肥大分化中起不同的作用，Wnt3a、Wnt5b促进软骨细胞分化延迟性肥大[41]。Wnt4和Wnt8有利于软骨分化而促进肥大。Wnt9a促进软骨细胞分化和增生。在MSCs期间，Wnt11表达促进软骨细胞Runx2和Ihh表达[42]。研究发现，8周的跑轮运动使高脂饮食小鼠骨骼Wnt抑制剂DKK-1信号的表达降低[43]，运动诱导的OA大鼠关节软骨Wnt-3a和β-catenin水平升高[44]。也有研究发现，儿童和青少年女性对单次对称性运动后1 h DKK-1总体显著下降，运动后24 h仍低于基线[45]。综上研究表明，运动通过激活Wnt信号通路对骨骼健康起调控作用[46]。
TGF-β/BMP信号通路:TGF-β在软骨的形成、软骨特性的维持和软骨内成骨过程中有非常重要作用。在TGF-βs中TGF-β1，2，3被视为软骨形成的诱导剂，通常可促进MSC的Sox9表达及软骨细胞基质的合成，并促进软骨细胞的合成代谢。BMP是TGF-β家族中的一个亚家族，经典的BMP信号通路通过Smad通路传导。TGF-β通过与ALK 4，5，7结合激活smads2/3信号。然而，TGF-β也可以绑定到在某些细胞类型ALK1及ALK2激活Smad，从而激活BMP通路。另外，TGF-β不仅有拮抗BMP2/4的功能，还能与细胞膜表面的TβRⅡ、TβRⅢ及ALK5受体结合，作用于下游的smad2/3，调节软骨Col2及Aggrecan等的合成[47]。在骨骼生长发育中，BMPs可能驱动软骨细胞形成后，进一步促进软骨细胞增生及软骨内骨化，而不是维持软骨细胞状态。TGF-β抑制软骨细胞终末肥大分化，通过Smad2/3维持正常软骨。然而，TGF-β1在人类已被证明可调控软骨细胞肥大化[48]。抑制TGF-β/Activin/Nodal信号，软骨细胞肥大增加，激活BMP/Smad1/5/8抑制TGF-β/Smad2/3的激活，这两个信号通路之间相互作用[49]。调节软骨细胞的肥大TGF-β和PTHrP控制软骨细胞增生周期，在小鼠体内中断TGF-β或PTHrP信号能引起软骨细胞增生减少以及过早分化导致侏儒症和骨骼畸形。有研究发现，运动促使大鼠膝关节软骨中TGF-β/ALK5/Smad2/3信号通路代偿性活化[50]，运动可能调控着生长板软骨细胞的增生平衡调控骨的纵向生长。
IGF信号通路:GH/IGF-1对青少年的快速增长十分重要，IGF-1在生长板中刺激软骨细胞的增生和骨生长，是软骨细胞增生和成熟，促进骨骼发育的重要生长因子。IGF-1信号也参与了甲状腺素、Wnt/β-catenin信号通路的相互作用，调控生长板软骨细胞增生分化[51]。研究表明，IGF-1和IGF-1受体(IGF1R)刺激生长板软骨细胞Wnt-4和β-catenin的表达。软骨细胞增生与终末分化，IGF-1和IGF1R可以部分抑制Wnt拮抗剂FRZB和DKK1。软骨细胞增生可能通过介导IGF-1、IGF1R触发PI3K/AKT GSK3途径，激活的Wnt/β-catenin通路促进细胞肥大[52]。事实上，IGF1-/-小鼠长骨的Ihh表达减少，而PTHrP表达增加。IGF1R-/-小鼠，IGF-1R在生长板静止层，增生层和肥大层等所有层软骨细胞的表达减少，IGF1R基因敲除对Ihh表达无影响，但PTHrPmRNA水平显著增加35%以上。IGF1R-/-小鼠的生长板，肥大层明显缩短，而增生层软骨细胞混乱，表明IGF-1信号调节Ihh和PTHrP的表达介导软骨细胞增生和存活，以此控制出生后细胞增生的成熟和基质的生成速度，从而调控骨生长[53]。有研究发现，IGF1作为骨骼发育的主要参与者，FAK激活IGF1R的及其下游效应物AKT和ERK，将生物力学力量转化为骨合成信号，运动可通过整合素调节IGF1R和下游靶点的激活，增强响应IGF1和机械刺激，刺激骨形成和骨生长[54]。房冬梅[3]研究发现，持续和间歇跑台运动增加雌性大鼠骨的纵向生长，显著提高了运动后24 h肝脏和血浆中IGF-1的水平，间歇跑台运动效果更佳。
FGF信号通路:FGF信号通路的受体在软骨细胞的分化过程中扮演着重要的角色。在软骨内成骨早期的间充质干细胞聚集中，FGF有着重要的作用。FGFR1、FGFR2、FGFR5、FGFR6、FGFR7、FGFR10在松散的间充质干细胞中表达，FGFR2和FGFR9在聚集的间充质干细胞中表达，FGFR3表达在软骨细胞的增生和分化阶段，FGFR1表达在预肥大和肥大阶段，FGFR2、FGFR9、FGFR18表达在软骨膜中。FGF2最早在软骨细胞和成骨细胞的细胞外基质内发现，内源性FGF2可由体内软骨细胞产生，并储存在细胞外基质，与不同的受体结合，对软骨细胞增生和成熟分化发挥的作用不同[55]。
FGFR3是一种酪氨酸激酶受体，在生长板增生带的软骨细胞表达，在生长板FGF9和FGF18是FGFR3的主要配体[56]。FGFR3不仅负调控软骨细胞的增生，而且还降低软骨细胞的肥大化能力，FGFR3下调会导致Ihh/PTHrP/BMP信号通路上调，有利于软骨细胞增生[57]。FGF18-/-小鼠，软骨细胞增生降低、骨骼血管化延迟和破骨细胞和成骨细胞的招募延迟，矿化延迟，这些无疑与软骨细胞肥大密切相关。研究发现，抗阻运动降低老年小鼠FGF-2的表达[18]，运动导致的FGF-2降低有利于骨的形成和生长[58]。
缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)信号通路：生长板软骨无血管组织，软骨细胞在低氧环境生存，因此缺氧被认为对软骨细胞健康和软骨基质形成有积极影响。有证据表明，低氧促进软骨形成和防止通过终端分PI3K/Akt/FOXO依赖的抗凋亡作用[59]。研究发现，HIF-1α能够增强BMP2诱导Sox9和软骨的形成，同时抑制Runx2和软骨内骨化过程。在胎肢培养中，HIF-1α、BMP2诱导的增生软骨区的扩张和抑制软骨细胞肥大的软骨内骨化[60]。而HIF-2α，确定调节软骨内成骨，增强Col10、MMP13和VEGF表达。有研究表明，HIF-2α与β-catenin和NF-κB通路促进软骨内成骨和软骨细胞凋亡。Runx2和Ihh被确定为HIF-2α的软骨内骨化可能转录目标，参与调控软骨细胞肥大分化[61]。乔盼迪研究发现，高强度运动通过HIF-1α表达抑制生长板增生层软骨细胞分泌Col2和肥大层细胞的肥大化能力，并使降低肥大层矿化速度，不利于骨的纵向生长[2]。
结论与展望生长板软骨细胞的肥大不是由单一的信号通路调控的，而是一个错综复杂信号调节网络。Wnt信号通路、TGF-β/ BMP、Ihh/PTHrP、FGF、IGF和HIF等多信号通路参与调节生长板软骨细胞肥大，影响级联途径导致转录因子Runx2，肥大标记性基因Col10、MMP-13、VEGF和整个成骨过程激活。这些信号通路之间的相互作用复杂而又精确地调控着生长板软骨内成骨的平衡。运动可能也通过这些通路调控骨的纵向生长。
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| (收稿日期：2018-12-28) |