Rubinstein-Taybi综合征(Rubinstein-Taybi syndrome，RSTS，OMIM#180849，#613684)是一种罕见的常染色体显性遗传病，其人群发病率为1∶100 000~125 000，在智力发育迟滞患者中为1∶500^[1]。患儿主要表现为特殊面容、智力损害、生长迟缓、指趾粗大。RSTS诊断依靠临床表现和突变分析。研究表明，RSTS与CREBBP和EP300致病基因突变相关。目前，55%~75%RSTS患者由基因突变分析确诊^[2]。

本研究对1 例不典型RSTS患儿采用二代测序技术进行相关基因检测，发现CREBBP基因突变，并结合文献，对该病的临床表现、基因突变和诊治策略进行探讨。

患儿男，9岁，主因“发现股骨头坏死，生长迟缓4年”就诊。其母有3次自然流产史(孕40 d左右)，患儿为第4胎，孕程顺利，足月头位顺产，无窒息史，出生体质量3.3 kg。6个月出牙，1岁3个月会走，2岁6个月会说话，7岁换牙。4岁前身高、体质量、智力发育与同龄儿无明显差别。4岁开始生长缓慢，身高较同龄儿中等偏下。8岁上一年级，学习成绩差，说长句有困难。4岁时家长发现其步态异常摇摆、跛行，上下楼梯时明显，未诉疼痛，无跌倒骨折史。外院诊为“双侧股骨头坏死”，行“ 双侧股骨头介入减压溶栓术”，术后家长觉患儿症状无缓解，仍有跛行。7岁时复诊再次行“双侧股骨头减压注药术”。症状无明显改善，遂来北京协和医院就诊。

查体：身高119 cm(＜3%)，体质量35 kg(＞75%)，体质量指数(body mass index,BMI) 21.7 kg/m²，上部量61 cm，下部量58 cm，指间距119 cm。步态摇摆，脸圆，颈短，未见颈蹼，眼距宽，可见内眦赘皮，双侧巩膜稍蓝，腭弓稍高，双眉倒人字。手指短，第4掌骨不短，双髋关节无压痛。阴毛Ⅰ期，阴茎长2.5 cm，周径3.5 cm，右侧睾丸未触及，左侧睾丸2 mL，质软。心、肺、腹及神经系统查体未见异常。

辅助检查：血常规 血红蛋白(hemoglobin,Hb) 138 g/L，白细胞计数 (white blood cell,WBC) 11.94×10⁹/L，血小板计数(platelet,PLT) 321×10⁹/L；血钙 2.47 mmol/L(正常参考范围2.13~2.70 mmol/L)，血磷1.83 mmol/L(0.81~1.45 mmol/L)，血清甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)42.4 ng/L (7~53 ng/L)；胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF1)181 μg/L(74~388 μg/L)，游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyroxine,FT3)2.91 ng/L(1.8~4.1 ng/L)，游离四碘甲状腺原氨酸(free thyroxine,FT4)9.5 ng/L(8.1~18.9 ng/L)，促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)2.09 μU/mL(0.38~4.34 μU/mL)，睾酮(testosterne,T)0.56 nmol/L(0.358~1.217 nmol/L)，雌二醇(estradiol,E2)0 ng/L(19.9~47.9 nmol/L)，促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)1.87 mU/mL(0~20.3mU/mL)，促黄体生成素(luteinzing hormone,LH)0.15 mU/mL(0.0~11.1 μg/L)，催乳素(prolactin,PRL)5.04 μg/L(2.1~11.7 μg/L)。骨盆正位片：符合双侧股骨头坏死改变。双膝、双腕关节正位片：双膝关节骨质疏松，双膝、腕关节骨龄低下，各掌指骨稍短。眼科会诊：杯盘比大，屈光不正，斜视。

根据患儿临床表现，考虑Rubinstein-Taybi综合征可能性大。在患儿及父母知情同意的前提下，采集患儿乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝血3 mL，使用Q1Aamp DNA Blood Mini Kit提取全基因组DNA，

按照标准操作流程进行DNA文库制备、芯片杂交和洗脱、质控合格后进行高通量测序、进行测序数据生物信息学分析、结果解读、筛选出具有临床意义的位点，并对位点进行Sanger法验证。文库制备是将1 μg基因组DNA打断成主带为200~300 bp小片段DNA，然后将打断后DNA片段进行末端补平，在3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，经Non-Captured PCR构建完成的文库，通过Nimblegen芯片将Exon capture区域进行富集，再通过PCR扩增富集后产物，最后通过杂交前后PCR产物QPCR检测获得序列捕获杂交效率。QPCR检测合格后，将一定数量的文库进行Hiseq上机测序。生物信息学分析主要分为初级分析、变异检测和变异注释3 个部分。初级分析部分包含read过滤、序列比对、比对结果去重、序列重比对、测序质量值校正等。变异检测部分是对初级分析部分处理后的比对结果文件进行分析并输出是变异检测结果文件。变异注释部分是对变异检测结果文件中的SNV和INDEL进行注释。结果解读是对SNV和INDEL注释结果按照ACMG解读规范进行解读。

生物信息学分析结果显示，此样本在芯片目标捕获区域平均测序深度为258X，其中测序深度达到20X以上的区域占芯片目标捕获区域的98.47%，对芯片目标捕获区域覆盖良好。对注释结果解读并结合患儿的临床表征，发现位于CREBBP基因14外显子的无义突变c.2464G＞T(图 1A)，导致CREBBP蛋白第822位甘氨酸突变为终止密码子(p.G822^*)，该突变在千人数据库、dbSNP数据库及hapmap数据库均无相关记载。患者母亲检测CREBBP基因(由于条件限制，未能采集患者父亲基因血)，未见与患者相同突变(图 1B)。

图 1 CREBBP突变分析 Fig 1 CREBBP mutation analysis A：患者杂合突变c.2464G＞T；B：患者母亲正常序列

图选项

1963年，Rubinstein等^[3]首次报道了1 例以特殊面容和指趾粗大为特征的临床综合征，后命名为Rubinstein-Taybi综合征。2015年，Milani等^[4]总结其临床症状如下：特殊面容(100%)、智力障碍(~100%)、隐睾(78%~100%)、小头畸形(35%~94%)、指趾粗大(96%)、说话晚(90%)、反复呼吸道感染(75%)、骨龄低下(74%)、便秘(40%~74%)、牙齿异常(73%)、胃食管反流(68%)、心电图异常(57%~66%)、肾脏异常(52%)、视力异常(＞50%)、生长迟缓(21%)等，其他可能合并的症状还包括先天性心脏病(24%~38%)、抽搐(25%)、瘢痕瘤(24%)、耳聋(24%)、恶性肿瘤(3%~10%)。其特殊面容主要包括内眦赘皮、眼睑下垂、突眼、外斜视、宽鼻梁、上颌发育不全、高腭弓。大部分患儿存在智力受损，新生儿期智力商数(intelligence quotient,IQ)值为25~79(平均值为36~51)^{[5, 6]}。患儿往往在胎儿期发育正常，出生后1年开始出现生长迟缓，同时缺乏青春期生长突增，以致身材矮小。2014年一项荷兰的研究提示，男性RSTS患者终身高为162.6 cm(-2.99 SD)，女性RSTS患者终身高为151.0 cm(-3.01 SD)^[7]。本例患儿除表现出典型的RSTS症状(特殊面容、生长迟缓、智力迟滞、骨龄落后)外，同时伴有该病尚未报道过的双侧股骨头坏死的症状，拓宽了该疾病的表型谱。

目前缺乏RSTS的明确诊断标准，主要结合临床和基因突变分析进行诊断。研究表明，该病与两个致病基因突变有关：编码cAMP调节的增强子结合蛋白的CREBBP和编码E1A结合蛋白的EP300基因。据已有文献，50%~70%的RSTS患者为CREBBP突变，5%~8%的患者为EP300突变。CREBBP和EP300均编码组蛋白乙酰转移酶，通过使组蛋白末端的赖氨酸乙酰化，改变其所带电荷性质，导致DNA-组蛋白相互作用减弱，进而有助于转录发生^[8]。二者还和RNA聚合酶Ⅱ的募集有关，作为多种转录因子如E2F、Jun、Fos等的共同活化剂，调节p53的泛素化和降解，参与一系列细胞活动如DNA修复、生长、分化、细胞凋亡及肿瘤抑制^[9]。CREBBP基因位于16p13.3，长约150 kb，编码含2 442个氨基酸的CREBBP蛋白，本例患儿发现CREBBP基因14外显子的杂合突变c.2464G＞T(p.G822^*)，该突变可导致CREBBP蛋白822位氨基酸以后所有结构域包括溴结构域(1 108~1 170位氨基酸)、组蛋白乙酰转移酶活性区(1 173~1 849位氨基酸)、EIA癌蛋白结合区(1 679~1 732位氨基酸)、蛋白激酶A磷酸化位点(1 711位氨基酸)、谷氨酰胺富含区(1 849~1 999位氨基酸)及C-末端的缺失^[10]，抑制CREBBP蛋白功能，影响其靶基因的表达，致病性明确。该突变在千人数据库、dbSNP数据库及hapmap数据库均无相关记载，考虑为新突变。

据文献报道，超过90%的RSTS患者可以成长到成年，但成年患者往往面临相关的临床问题，随时间推移，超过32%的RSTS患者生活能力逐渐下降，37%的RSTS患者行为障碍逐渐加重^[5]。同时RSTS患者存在恶性肿瘤易感性，尤其是神经系统的肿瘤^[4]。根据2015年由Milani等^[4]最新提出的建议，RSTS患儿临床诊断后需进行运动神经系统、听力、视力、骨骼、心血管、皮肤及内分泌系统评估，以及头颅MRI、肾脏超声检查和基因检测；之后在6个月、1岁、18个月、2岁、30个月、大于3岁时，需进行以听力、视力、骨骼和牙齿评估为重点的系统评估；达到青春期后，需再次进行上述所有评估，以及压力测试。根据不同患者的不同情况，尤其是眼科特征、肥胖倾向和特殊的情绪障碍，其随访策略可以有个体性差异。

尽管目前针对RSTS的诊断和机制研究已经取得了很大的进展，仍有很多有待解决的问题。关于RSTS的基因型-表型相关性目前尚无明确结论，有报道称大片段缺失与严重智力低下及孤独症有关^[11]，一些研究发现EP300突变的患儿症状较轻但其母发生先兆子痫的概率增加^{[10, 12]}，未来需要更多病例研究以探讨其基因型-表型相关性。目前40%的患者并未发现CREBBP和EP300的突变^[13]，提示其他致病基因的存在，进一步研究可通过全外显子测序等高通量测序技术寻找新的致病基因。另外，其并发症种类繁多且无特异性，增大了制定常规且有效的诊治-随访流程的难度。

致谢：感谢患者及家属对本研究的支持。