骨的矿化是无定形的磷酸钙演变为羟基磷灰石结晶并沉积于骨的有机质间隙内的过程，其中成骨细胞是骨组织矿化过程中最活跃的细胞，具有合成和分泌骨胶纤维和基质的功能^[1]。当成骨细胞失去活性，便会导致骨质疏松症。目前有研究认为一定程度的铁蓄积可通过Fenton反应诱发活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 损伤，进而促进骨质疏松发生、发展^[2-3]。那么ROS通过影响骨代谢何种过程，目前鲜有报道。本研究通过提取新生小鼠颅骨成骨细胞，利用铁剂干预造成高铁环境，观察细胞成骨活性、矿化能力的改变，以阐明ROS在铁蓄积抑制成骨细胞活性中的作用。

材料和方法 主要材料与仪器

新生ICR小鼠；枸橼酸铁铵 (ferric ammonium citrate，FAC)：美国Sigma公司；改良型α-MEM：美国Gibco公司；胎牛血清：美国Gibco公司；Trizol：美国Invitrogen公司；碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 染色试剂盒：上海碧云天公司；荧光定量PCR mix：美国Madison公司；酶标仪：美国Thermo公司；荧光定量PCR仪：美国A B applied biosystems公司。

实验方法

细胞培养：新生ICR小鼠于无菌条件下，取出小鼠颅骨，剔除结缔组织，将颅骨剪成0.5 mm×0.5 mm碎块，于75%乙醇浸泡10 min，将浸泡后的颅骨置于胰酶/胶原酶 (1:3) 混合液中孵育20 min，采用梯度消化及差速贴壁法提取并提纯小鼠原代成骨细胞。细胞常规培养于改良型α-MEM培养基 (含10%的胎牛血清、青霉素100 μg/mL和链霉素100 μg/mL)，5% CO₂、37 ℃条件培养。根据细胞的培养情况每3~4 d换液1次，细胞密度长至70%~80%时进行传代。取第3代细胞进行下一步实验。

ALP及茜素红染色：将传至第3代的原代成骨细胞接种于6孔板中，每孔5×10⁵个。细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为50 μg/mL抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，细胞分为2组，一组 (Fe) 加入终浓度为10 μmol/L的FAC，另一组设为对照组 (Con, 加入不含FAC的等量培养基)。每组3个复孔。培养7 d后，用ALP染液染色，步骤照说明书进行。培养21 d后行茜素红钙结节矿化染色，计数随机6处视野中央处0.5 cm×0.5 cm小方格内细胞形成的钙结节数目。茜素红染液由茜素红粉加PBS溶解后配制。

二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯 (DCFH-DA) 氧化应激荧光检测：原代成骨细胞以5 000/孔的密度接种于96孔板，细胞贴壁24 h后更换无血清培养液，并参照实验分组干预，7 d后加入浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，摇晃混匀，于37 ℃培养箱内避光孵育30 min，以无血清培养基洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的DCFH-DA。然后收集细胞，置荧光显微镜下以FITC荧光光谱观察并拍照。

实时定量PCR检测：采用实时定量PCR 2^-△△CT法。将原代细胞接种于6孔板中，每孔5×10⁵个。细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为50 μg/mL抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠，干预分组方法同上，每组设置3个平行样。干预72 h后，使用Trizol试剂常规提取细胞总RNA，经逆转录成cDNA。总反应体系体积20 μL：cDNA 0.2 μL+SYBR Green Supermix 10 μL+正反引物各1 μL+dd水8.8 μL。各基因引物序列及产物大小如下，人Runt相关转录因子2(Runx2)，上游：5′-AACTTCCTGTGCTCCGTGC TG-3′，下游：5′-TCGTTGAACCTGGCTACTTGG-3′；内参GAPDH，上游：5′-CCTGGAGAAACC TGCCAAGTA-3′，下游5′-TCATACCAGGAAAT GAGCTTGAC-3′。使用2^-△△CT法计算PCR产物的相对值。最终结果由BioRad CFX96分析得出。

统计学方法

实验中测定结果重复3次，采用统计分析软件SPSS17.0进行分析，实验所得数据用均数±标准差 (x±s) 表示，采用t检验进行分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果 细胞ALP及茜素红染色结果

两组细胞相比，铁剂干预后ALP蓝染明显减弱，钙结节染色：0.25 cm²面积内钙结节计数Con组 (15.00±1.67) 较Fe组 (11.67±2.50) 明显增多 (P=0.020)(图 1)。

活性氧检测结果

随着FAC干预，ROS绿色荧光强度明显增强，细胞荧光数目明显增加 (图 2)。

Q-PCR检测结果

与对照组 (1.00±0.28) 相比，高铁组成骨相关基因Runx2 mRNA表达量 (0.35±0.20) 明显降低，差异有统计学意义 (P=0.030)(图 3)。

讨论

近年来有研究报道，“铁蓄积”是骨质疏松症 (尤其是绝经后骨质疏松症) 的一个独立危险因素，国内外对于大体、细胞、临床研究都证实了该观点^[4-5]。那么，铁作为一种人体必需的微量元素，究竟通过何种机制促使骨质疏松的发生目前还不甚明朗。本研究立足于原代成骨细胞，希望通过研究铁剂对骨形成过程的影响，进一步阐明、揭示铁对骨代谢的作用。

本研究采用新生小鼠颅骨提取的成骨细胞，相较于以往细胞系的实验，本研究结果更具说服力^[6]。提取后的成骨细胞分为两组：Con组与高铁 (Fe) 组，铁剂FAC的干预剂量参考以往研究^[7]。骨源性ALP是成骨细胞的表型标志物之一，它可直接反映成骨细胞的活性或功能状况。本研究通过ALP染色来反映铁剂对成骨细胞活性的影响。研究表明，FAC能显著抑制ALP活性，该结果与本研究茜素红实验结果一致。成骨细胞的功能通常以骨矿化能力，即钙结节形成能力来衡量，其中茜素红染色能直观地反映钙结节形成能力。本研究结果提示铁剂能抑制骨矿化能力。为进一步论证铁对成骨细胞的作用，本研究采用Q-PCR方法检测成骨相关基因Runx2表达水平。Runx2是转录因子Runxx家族成员之一，作为成骨细胞的特异转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。因此，检测Runx2基因表达能进一步观察成骨细胞活性改变。研究表明, FAC干预后的成骨细胞Runx2基因表达能力仅为对照组的0.35倍，明显受到抑制，该结果与本研究前期研究结果一致。

最近的研究表明，铁对骨质疏松症的促进作用可能与活性氧水平升高有关。铁离子增多导致转铁蛋白活性受抑制，血清、肝脏中的铁蛋白水平升高，细胞中的铁离子则通过Fenton反应催化氧自由基的形成，这些自由基统称活性氧ROS，其能激活下游相关信号转导通路，进一步抑制成骨细胞成熟^[8]。因此，ROS在骨质疏松症伴铁蓄积的发病机制中地位非常重要。本研究利用DCFH-DA探针，通过检测ROS荧光强度，来反应活性氧水平的高低。结果显示，铁剂能明显升高ROS水平。因此，有理由相信，“铁蓄积”通过Fenton反应升高ROS，ROS抑制成骨细胞成熟导致成骨功能下降，进而促使骨质疏松发生、发展。

综上所述，本研究发现，氧化应激在铁抑制成骨细胞活性中的作用非常重要，铁剂可能通过下调骨形成能力导致骨质疏松症。本实验是FAC对成骨细胞作用的进一步研究，但FAC上调ROS后又导致哪些通路的改变，仍需要进一步的探索。