骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨骼疾病，其特征在于骨量低和微观结构的破坏，且容易发生骨折^[1]。废用性骨质疏松症(disuse osteoporosis，DOP)属继发性OP的一种，是由于机械应力刺激减少而引起局部或全身骨量丢失所致的OP^[2]。近年来因各种老年性疾病、突发状况而长期卧床所导致的骨功能失用，以及宇航员DOP的高发生率，已引起了重视。目前防治DOP药物价格普遍比较昂贵，治疗效果不持久且不良反应较大。因此，寻找价格便宜、治疗效果持久且不良反应小的药物很有必要。

葛根作为传统中医药，在我国具有分布广泛，价格低廉的优势^[3-4]，其主要成分是葛根素^[5]，葛根素属于异黄酮类化合物^[6]，具有雌激素样活性^[7-8]，与具有抗OP作用的大豆异黄酮在化学结构上相似。有文献报道葛根素能通过促进成骨细胞分化和增生^[9-11]、抑制骨吸收调控骨代谢^[12-14]。研究发现其在去卵巢雌性大鼠^[15]、老龄化以及糖皮质激素^[16]等诱导的OP模型中抗OP效果稳定。本实验以大鼠尾吊模型即后肢悬浮模型为DOP模型，探讨葛根素防治尾吊大鼠发生DOP的效果，对于探究中医药发挥防治OP效果以及开发葛根类新药有重要的意义。

材料与方法

仪器与试剂

双能X线骨密度仪(Prodigy，GE公司，美国)，AG-X系列台式电子万能试验机(岛津公司，日本)，硬组织切片机(SP1600，LEICA公司，德国)，酶标仪(BioTeK公司，美国)，BX53型正置显微镜(奥林巴斯公司，日本)，4A型数显多头磁力恒温搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)，水合氯醛(天津大茂化学试剂公司，中国)，ELISA骨形成指标P1NP试剂盒(IDS公司，英国)，ELISA骨吸收指标CTX-1试剂盒(IDS公司，英国)。

药品

葛根素购自于宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：20160711，由豆科植物野葛干燥根中提取，分离得到的8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羟基异黄酮，化学式为C₂₁H₂₀O₉，具有抗氧化、改善微循环等多种药理活性，本品呈干燥白色结晶性粉末，贮存2~8 ℃，纯度>98%。

实验动物

2月龄Wistar雌性大鼠30只，体质量160~180 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心, 实验动物许可证号:SCXK(甘)2015-0002，在SPF级实验中心动物房饲养，饮食、饮水无限制。

分组

将实验动物采用数字表法进行完全随机化分组：对照组(Control组)，尾吊组(HLS组)，尾吊+葛根素组(HLS+Pur组)，每组10只。

尾吊造模

用75%乙醇涂搽大鼠尾巴的表面，去除不洁净的油脂和皮屑，防止感染。将大小适中的医用透气橡皮膏粘贴于需尾吊大鼠远离尾尖部4~5 cm处，附着上制作好的钢丝环，加绕橡皮膏2~3圈固定。尾吊笼子里面的钢环挂钩和钢丝环锁定在一起，通过调节锁链的长短，保持大鼠头低尾高，身体纵轴倾斜与水平轴呈30°左右的夹角，此夹角是尾吊比较适宜的角度^[17-18]，使大鼠的双后肢在伸直状态下与笼子底部半分离，不能自由活动，前肢着地可自由活动和饮食饮水，即大鼠整体处于废用性状态。

配药及给药

将葛根素粉末少量多次倒入研钵中，一边加蒸馏水一边反复研磨，使葛根素能够充分的溶解于蒸馏水中，配制成1.54 g/L的混悬液，HLS+Pur组以每只大鼠15.4 mg/(kg·d)给药，Control组和HLS组灌同等体积的蒸馏水，每周测一次体质量，根据体质量调整给药剂量。葛根素剂量来源于前期课题组葸慧荣等^[19]验证应用的有效葛根素给药剂量，即15.4 mg/(kg·d)。

组织病理学检测

剥离实验大鼠的肝、脾、肺、肾、肾上腺等脏器，使用甲醛溶液浸泡固定，经石蜡包埋HE染色，显微镜下观察组织病理学结果。

骨密度测定

实验大鼠干预4周后，水合氯醛腹腔麻醉，采用腹主动脉采血处死，剥离大鼠的股骨、椎骨，用0.9%氯化钠注射液浸润过的纱布包裹冻存于-20 ℃冰箱，骨密度(bone mineral density，BMD)测定时，自然解冻，置于双能X线BMD检测仪下，检测左侧股骨和椎骨的BMD。

骨生物力学测定

将检测完离体BMD的左侧股骨，放于AG-X生物力学万能机上，以跨距15 mm，加载速度10 mm/min进行三点弯曲实验，记录最大载荷和弹性模量，改换压缩模具，第5腰椎(L5)用砂纸反复打磨至两头平滑之后，置于万能机的不锈钢平台上，以2 mm/min的速度持续行进施加压力，记录最大载荷和弹性模量。

血清生化指标检测

用动脉取血法抽取大鼠血样，5 000 r/min离心15 min，将上层血清冻存于-80℃的冰箱，ELISA试剂盒测定骨形成指标P1NP和骨吸收指标CTX-1，于酶标仪在450 nm检测并运用标准曲线计算出样品中含量，单位为μg/L，试剂盒均来自于IDS公司。酶标仪检测血清的长期变异系数(coefficient of vatiation, CV)为 < ±0.15%，注液精度CV为≤2%(每孔注液300 μL时)。

骨形态计量学检测

在实验进行到13、14 d时，以30 mg/kg剂量给予颈部皮下注射盐酸四环素；23、24 d时，以8 mg/kg剂量给予颈部皮下注射钙黄绿素。分离出的左侧胫骨固定后，经70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，正丁醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各两小时，1号试剂(甲基丙烯酸甲酯200 mL，邻苯二甲酸二丁酯50 mL，二甲苯250 mL)、2号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)、3号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，过氧化苯乙酰10 g在37 ℃烘箱干燥24 h，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)各5 d脱水浸泡，4号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，过氧化苯乙酰30 g在37 ℃烘箱干燥24 h，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)60 ℃水浴凝固不脱钙塑料包埋法进行包埋，包埋体置于SP1 600硬组织切片机切片，厚度为610 μm，每个标本切取两张，用1200目的砂纸打磨成形，1500目砂纸精细打磨至几乎与塑脂载玻片同一水平线，一张镜下观察荧光标记及进行荧光量化，另一张经过VG染色，显微镜下观察染色结果，并采用IPP6.0软件进行量化分析。1~4号试剂均需磁力珠搅拌12 h充分混合所配成。

统计学方法

采用SPSS21.0软件进行数据统计分析，用均值±标准差(x±s)表示，不同组间差异用单因素方差分析，符合正态分布且方差齐性用LSD，不符合方差齐性用Games-Howell，进行两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

组织病理学检测

病理学镜下观察发现各脏器均未表现出明显损伤，尾吊模型对脏器损伤较小，实验所采用的葛根素剂量对大鼠组织无不良损伤，无任何不良反应(图 1)。

BMD检测结果

与对照组相比，HLS组左侧股骨和椎骨的离体BMD均明显降低(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组左侧股骨和椎骨的离体BMD均有不同程度升高(P < 0.01)(图 2)。

骨生物力学检测结果

与对照组相比，HLS组左侧股骨和椎骨的最大载荷和弹性模量均显著下降(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组左侧股骨和椎骨的最大载荷和弹性模量均有上升(P < 0.01)(图 3)。

血清生化指标检测结果

与对照组相比，HLS组骨形成指标P1NP含量显著减少(P < 0.05)，骨吸收指标CTX-1含量显著增加(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组骨形成指标P1NP含量有显著增加(P < 0.01)、骨吸收指标CTX-1含量显著减少(P < 0.01)(图 4)。

荧光标记结果

在20倍物镜下，可见不同组荧光素之间的距离存在差距(图 5)。与对照组相比，HLS组四环素与钙黄绿素之间的距离显著变小(P < 0.01)，而HLS+Pur组四环素与钙黄绿素之间的距离较HLS组显著变大(P < 0.01)(图 6)。

VG染色结果

在4倍物镜下，可见尾吊之后骨小梁比较稀疏，与对照组相比，HLS组的骨小梁数目明显减少、骨小梁的厚度明显变薄、骨小梁分离度明显变大，差异均有统计学意义(P < 0.01)(图 7)；而对于葛根素灌胃防治组，骨微结构得到了一定改善，与HLS组相比，HLS+Pur组的骨小梁数目明显增加、骨小梁厚度增加、骨小梁分离度明显变小，差异均有统计学意义(P < 0.01)(图 8)。

讨论

我国人口老龄化进程的加速、交通事故的意外频发导致逐年增长的DOP发病率已经严重危害了人民的身体健康，而载人航天时宇航员的失重等也可引起DOP，阻碍了我国航天事业的步伐。中医药治疗DOP有着悠久的历史和丰富的经验，越来越得到国内外各界的关注。

中医学中无“废用性骨质疏松”病名，根据其病因病机以及症状，可归属于“骨痿”的范畴。此前，中医临床上常采用具有补肝肾、强筋骨的淫羊藿、骨碎补、菟丝子、蛇床子以及活血化瘀的丹参等药物治疗。葛根甘、辛、凉，归脾胃经，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻等功效，常被用于颈椎病和心脑血管病的治疗^[20-21]。葛根素作为葛根的主要活性成分，现代药理学研究认为其在抵抗心率失常、降血压、保护心肌结构、扩张脑血管、改善微循环、降血糖等多方面都有效果。近年来研究发现葛根素对多种OP有非常好的防治作用，其在预防与治疗DOP方面的作用尚未见报道。本实验初步探究并明确其对DOP模型的防治作用及其机制。

尾吊模型由美国宇航局建立并经Wronski等^[22-23]提出和发展，能很好地模拟因患者卧床和航天员失重等引发的DOP。BMD作为OP的诊断标准，早在1994年已经被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)所采纳^[24]。

BMD越低、骨强度越弱，越容易发生骨折。本实验大鼠尾吊4周以后，与对照组相比，显示股骨和椎骨的BMD明显降低，而经葛根素灌胃后，BMD显著上升，骨量明显增加，表明葛根素可能通过提高BMD预防OP。骨生物力学和骨形态计量学是检测骨质量的重要指标，骨生物力学能够准确测量骨受力与骨韧性的表现情况，骨受力越弱弹性模量越小、OP发生可能性越高。骨形态计量学作为骨微观的反映，能够确切描述骨小梁的情况，骨小梁数目越少、厚度越薄、分离度越大，证明骨质越稀疏。尾吊模型大鼠应用葛根素以后，骨受力明显变大，骨韧性明显上升，骨小梁数目也显著增加，骨小梁厚度明显增加、分离度明显变小，骨骼的机械强度增加且骨微结构得到改善，表明葛根素可以通过提高骨生物力学指标和改善骨形态计量学参数，防治DOP的发生。血清生化指标能客观测定骨形成和骨吸收状态，从本研究血清生化指标的改变可以看出，葛根素防治组P1NP含量活性显著增加，CTX-1活性含量显著减少，葛根素促进了骨形成因子的表达、降低了骨吸收因子的表达，揭示葛根素同时参与了骨形成和骨吸收过程，能促进骨形成、抑制骨吸收。

综上所述，葛根素可以通过提高BMD，提升骨生物力学参数和改善骨微结构，并参与骨形成和骨吸收，对尾吊大鼠发生DOP起到良好的防治作用，为葛根素进一步应用于临床提供了依据。