成熟骨组织的维系依赖于骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell, BMSCs)来源的成骨细胞的骨形成与造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)来源的破骨细胞骨吸收之间的动态平衡关系[1]。在正常骨稳态下，上述两者之间的动态平衡受到精细调控，这是维系正常骨量和更新骨组织的先决条件。然而，随着年龄的增长、绝经或其他病理状态的出现，骨形成与骨吸收之间的动态平衡被打破，当骨吸收超过骨形成时，将导致骨量减少甚至骨质疏松症的发生[2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是在转录后水平调控基因表达的重要因子，存在于多种体液中，状态稳定且不易降解，可以长期储存和反复冻融，有成为评估慢性多因素疾病的生物标志物的发展前景[3-4]。研究发现与无骨折史的骨质疏松症患者相比，伴有骨折史的骨质疏松症患者的血清中可发现某些miRNA的特异性表达。miRNA可通过抑制mRNA翻译来调节骨代谢相关细胞的活动, 对成骨细胞和破骨细胞的生成均具有调控作用。本文将对miRNA在成骨和破骨细胞分化及功能的调节作用方面的研究进展作一综述。
miRNA概述miRNA是一种非编码单链小分子核糖核酸，经Ⅲ型核糖核酸酶剪切含有发夹结构的内源性转录产物而产生，一般长度为19~24个核苷酸。miRNA的调控作用是基因表达非常重要的环节，通过以碱基互补配对的方式与目的信使RNA(mRNA)分子结合，影响3′末端的非翻译区蛋白复合物合成[5-7]。异常表达的miRNA失去对目的基因的调控作用，可导致如癌症、心力衰竭、免疫系统疾病以及骨质疏松症等多种疾病的发生[8-9]。
miRNA在成骨细胞介导的骨形成中的作用BMSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，是成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化前体，其向成骨细胞的分化是促进骨形成的关键环节。随着年龄的增长，BMSCs向成骨细胞分化的能力减弱，而向脂肪细胞分化的能力相应增强，导致年龄相关的骨量减少和骨髓内出现脂肪细胞的堆积[10]。miRNA可参与调节BMSCs的多向分化以及成骨细胞介导的骨形成的各个环节。本部分将对特异性正向和负向调控骨形成的miRNA及其发挥作用的机制进行总结，包括对BMSCs多向分化、细胞凋亡、矿化水平的调控，以及在低氧、高糖或高糖皮质激素环境下的调节作用。
正向调控骨形成的miRNAWang等[11]发现miRNA-5100水平在小鼠骨髓基质细胞系(ST2)和小鼠成骨细胞系(MC3T3-E1)分化过程中显著上调。研究证明miRNA-5100的靶点为成骨细胞生成的抑制性因子Tob2，miRNA-5100与之结合并抑制其表达。而Tob2具有降解成骨细胞转录因子Osx的作用，提示miRNA-5100可能通过抑制Tob2对Osx的降解，间接促进成骨细胞分化。Guo等[12]发现老年小鼠和人类BMSCs中miRNA-23a和miRNA-23b(miRNA-23a/b)的水平显著下降。而使miRNA-23a/b在BMSCs中过表达则可促进BMSCs向成骨细胞分化，反之下调miRNA-23a/b的表达水平则促进BMSCs向脂肪细胞分化。进一步研究表明跨膜蛋白64(Tmem64)是miRNA-23a/b的靶基因，Tmem64参与BMSCs分化的调控。过表达miRNA-23a/b可抑制内源性Tmem64蛋白的水平，下调miRNA-23a/b则升高Tmem64蛋白水平，而Tmem64的mRNA水平没有变化，说明miRNA-23a/b可能在转录后水平通过抑制Tmem64达到调控BMSCs向成骨方向分化。该研究提示通过改变miRNA-23a/b的表达水平可促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化，从而促进骨形成。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)中的一员，可以诱导干细胞向成骨细胞分化，其中BMP-9可在骨代谢相关疾病中发挥促进骨生成的作用。Song[13]等检测小鼠多向分化干细胞(metanephric mesenchyme cell, MMC)中由BMP-9介导的成骨分化中miRNA的表达，发现miRNA-21水平显著上调，进一步研究则发现miRNA-21通过与BMP-9发挥协同作用，增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的表达和钙沉积来促进骨形成。而Dong等[14]向MC3T3-E1细胞系转入miRNA-150，应用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)验证了骨形成标志物如骨钙素(osteocalcin, OC), ALP, Ⅰ型胶原蛋白以及骨桥蛋白(osteopontin, OPN)水平均升高。生物信息学分析结果提示miRNA-150可能通过与具有胶原蛋白酶活性的MMP14基因结合促进MC3T3-E1细胞矿化。细胞凋亡检测发现下调MMP14表达、同时上调miRNA-150表达可以显著降低MC3T3-E1细胞凋亡率，而下调miRNA-150表达则会促进细胞系凋亡。
骨转录因子Runx2是已知成骨细胞分化信号的下游关键转录因子，Vishal等[15]通过芯片分析发现miRNA-590-5p具有促进成骨分化的作用。使小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone mesenchymal stem cell, mBMSC)中miRNA-590-5p过表达，可发现小鼠骨基质中钙的沉积增加，ALP和I型胶原蛋白的mRNA表达也增加。经荧光素酶报告基因系统证实，Smad7的3′UTR是miRNA-590-5p的直接靶点，Smad7是Runx2的共因子，可通过降解Runx2来发挥抑制成骨分化的作用。因此，该研究提示miRNA-590-5p通过与Smad7基因结合并抑制其表达来间接保护Runx2蛋白，从而发挥促进成骨分化的作用。
此外，某些miRNA还可通过抑制成骨细胞凋亡来促进骨形成。低氧可导致人类MSC凋亡，抑制成骨细胞生成。Qiu等[16]发现给予表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)可在低氧条件下抑制成骨细胞凋亡、促进其分化，在此过程中miRNA-210表达水平升高。miRNA-210过表达，其靶基因酪氨酸激酶受体配体A3(ephrin A3.EFNA3)水平显著下降。证明EGCG通过上调miRNA-210水平，使其抑制EFNA3的表达来改善低氧导致的细胞凋亡和成骨细胞生成抑制。Sun等[17]也发现miRNA-210在低氧条件下具有抑制成骨细胞凋亡的作用。在人类骨折组织中过表达缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)可发现miRNA-210水平升高，低氧环境下培养的成骨MG-63细胞系中也可发现这一变化。实验证明miRNA-210类似物可促进成骨细胞生长，miRNA-210过表达可抑制细胞凋亡。进一步研究发现，miRNA-210通过抑制半胱天冬酶3和半胱天冬酶9的活性发挥抑制细胞凋亡的效应，提示miRNA-210具有促进骨折愈合的作用。
Fan等[18]发现miRNA-135b在人类股骨头坏死组织中表达水平较高。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein Kinase, AMPK)可以增加还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)活性，对抗地塞米松导致的氧化应激。在人成骨OB-6细胞和FOB1.19细胞中过表达miRNA-135b，Ppm1e基因水平下调，AMPK信号通路被激活，成骨细胞得到保护。而在不表达Ppm1e的成骨细胞中，过表达miRNA-135b则出现相反结果。故miRNA-135b通过抑制Ppm1e间接激活AMPK以对抗地塞米松造成的氧化应激，从而保护成骨细胞。亦有研究发现miRNA-216a可通过调控c-Cbl介导的PI3K/AKT通路促进成骨细胞分化、增加骨形成[19]，从而拮抗地塞米松对成骨细胞的抑制作用。
糖尿病患者较易发生骨质疏松症性骨折，研究发现miRNA-378可在高糖条件下保护成骨细胞[20]。在MC3T3-E1细胞系和小鼠体内模拟高糖诱发骨质疏松症的模型，可检测到miRNA-378表达水平下降，而过表达miRNA-378则可拮抗高糖对成骨细胞分化的抑制作用。进一步研究发现高糖环境下miRNA-378通过与半胱天冬酶3(caspase 3, CASP3)基因结合并阻断其mRNA和蛋白的表达，同时激活PI3K/Akt信号通路发挥这一效应。
负向调控骨形成的miRNAWNT/β-catenin信号通路是调控细胞生长、发育和分化的经典通路[21]，在成骨细胞的分化及骨形成过程中发挥重要作用。细胞外WNT蛋白通过与细胞膜受体结合，使细胞内的β-链蛋白(β-catenin)浓度升高，β-catenin进入细胞核内与转录因子结合，最终诱导靶基因如Runx2、Osx等的表达。Qiu等[22]测定了人类骨髓间充质干细胞(hMSC)的WNT信号通路中起调控作用的miRNA，发现miRNA-141-3p可以抑制WNT信号通路介导的骨形成。进一步研究证实miRNA-141-3p通过降低ALP活性、抑制基因表达，使细胞停留在细胞周期的G1阶段，从而抑制hMSC增生，并通过减少骨基质矿化来抑制hMSC向成骨细胞分化。生物信息学、Western blot法以及3′UTR报告分析表明，细胞分裂周期素25A(CDC25A)是miRNA-141-3p的直接靶点，应用小干扰RNA(siRNA)干扰CDC25A，则会抑制hMSC的增生和向成骨细胞的分化。提示miRNA-141-3p是通过抑制CDC25A来抑制hMSC增生及其向成骨细胞的分化。
BMP与BMP受体结合，激活Smad/MAPK信号通路传递信号，使得下游转录因子磷酸化而发挥促进成骨细胞分化的作用。Fu等[23]应用RT-PCR测定BMP2诱导的MC3T3-E1和BMSC向成骨细胞分化过程中miRNA的表达，发现miRNA-100的表达量降低。过表达miRNA-100会使得靶基因Smad1的蛋白水平降低，而应用miRNA-100抑制剂则会使Smad1蛋白水平升高。Smad1是BMP介导的Smad/MAPK信号通路中的下游关键调节因子，说明在BMP诱导成骨细胞分化的过程中，miRNA-100对Smad1蛋白具有内源性弱化作用，促进成骨分化的信号通路因而受到抑制。
miRNA还可通过促进BMSC向脂肪细胞分化、抑制其向成骨细胞分化来抑制骨形成。Li等[24]发现与青年人相比，中老年人BMSC中的miRNA-188的表达水平明显增高。研究证实BMSC特异性敲除miRNA-188的小鼠发生年龄相关骨质疏松症的概率大幅降低，而过表达miRNA-188时则较易发生年龄相关骨质疏松症以及骨髓内脂肪堆积。向骨髓内注射miRNA-188的MSC特异性抑制剂核酸适配体，则出现骨形成增加和骨髓脂肪堆积减少，说明随年龄增长而表达增加的miRNA-188可抑制BMSC向成骨细胞分化，转而向脂肪细胞分化。亦有报道称miRNA-27a具有类似作用[25]。miRNA微阵列分析绝经后骨质疏松症患者血清中miRNA的表达，发现血清中miRNA-27a水平显著降低；对骨质疏松症患者BMSC进行测定，可见成骨细胞生成被抑制，脂肪细胞生成增加。双荧光素酶报告基因系统证实肌细胞增强因子2c(Mef2c)是miRNA-27a的靶点。Mef2c是一种参与多种生理过程的转录因子，研究表明其参与对成骨细胞分化的调控, 提示miRNA-27a是通过抑制Mef2c促进BMSCs向脂肪细胞分化、抑制其向成骨细胞分化。
另有报道称miRNA也参与糖皮质激素(glucocorticoid, GC)介导的成骨细胞增生抑制[26]。向成骨细胞中加入地塞米松，miRNA-199a-5p的表达水平增加。使miRNA-199a-5p在成骨细胞中过表达，可显著增强地塞米松对成骨细胞增生的抑制作用，下调miRNA-199a-5p的表达则会得到相反结果。荧光素酶报告基因系统证实miRNA-199a-5p通过与WNT的3′UTR靶点结合，在转录后水平发挥对二者的抑制作用。WNT信号通路是GC介导的骨形成关键通路，调控BMSC向成骨细胞或脂肪细胞分化。因此，miRNA-199a-5p通过调控WNT信号通路，协助GC抑制的成骨细胞增生。
Gong等[27]给予高糖和游离脂肪酸在MC3T3-E1细胞系中建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)模型，发现成骨细胞分化明显受到抑制，在此过程中miRNA-132的表达显著增加。在T2DM模型中过表达miRNA-132可抑制成骨分化，表现为骨形成关键标志物ALP表达下降；而下调miRNA-132的表达则会促进成骨细胞分化。进一步研究发现去乙酰化酶1(Sirt1)是miRNA-132的靶基因，外源性过表达Sirt1会抵消miRNA-132导致的成骨细胞分化抑制。过氧化物酶体增生物活化受体b/d (PPARb/d)是Sirt1的下游调控因子，利用PPARb/d特异性siRNA对其进行敲除，可消除Sirt1对成骨细胞分化的作用。提示miRNA-132通过抑制Sirt1间接阻断其下游PPARb/d来抑制成骨细胞分化。
综上所述，目前发现很多miRNA可通过调节BMSC的多向分化、细胞凋亡、细胞矿化水平影响骨形成，并在低氧、高糖、高糖皮质激素环境下发挥不同调节作用。这些miRNA还可以反映骨形成的情况，为骨质疏松症的发生揭示新机制、指出可能的治疗方向。
miRNA在破骨细胞介导的骨吸收中的作用破骨细胞是巨噬细胞/单核细胞系起源的细胞，与骨基质吸收相关[24, 28]。某些特异性表达的miRNA可调控破骨细胞分化、前体增生，从而影响骨基质吸收。破骨细胞前体增生、分化为成熟破骨细胞的各个环节均可受到miRNA的调控。本部分将对特异性正向和负向调控骨吸收的miRNA及其发挥作用的方式进行总结，如miRNA对破骨细胞分化、活动及细胞凋亡等生理过程的调控作用。
正向调控骨吸收的miRNA核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)信号通路可以刺激破骨细胞分化，Mizoguchi等[29]在有、无RANKL存在的条件下，比较骨髓起源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMM)中miRNA的表达，结果发现miRNA-31在RANKL存在时表达增加。当下调miRNA-31后，RANKL激活的破骨细胞生成和骨吸收活动受到抑制。RhoA是miRNA-31的靶基因，为了验证miRNA-31是否通过调控RhoA的表达使骨吸收活动处于最佳状态，应用RhoA抑制剂C3胞外酶对其进行抑制，结果发现C3胞外酶可抵消miRNA-31导致的骨吸收增加。提示miRNA-31可以通过与RhoA结合并抑制其表达来促进骨吸收。
Miller等[30]证实转录因子RBP-J对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的破骨细胞生成和炎性骨吸收具有抑制作用，并发现miRNA-182水平在炎性骨吸收过程中发生变化，且该变化可被RBP-J抑制。在无RBP-J条件下，下调miRNA-182表达可显著抑制TNF-α诱导的破骨细胞生成。基因Foxo3和Maml1是miRNA-182的直接靶点，二者在TNF-α调控的破骨细胞生成中发挥抑制性作用，RBP-J调控的miRNA-182通过抑制Foxo3和Maml1促进TNF-α诱导的破骨细胞生成。
dela Rica等[31]发现两组miRNA在人类单核细胞向破骨细胞分化过程中发生改变：miRNA-212/132和miRNA-99b/let-7e/125a。特异性敲减这些miRNA会抑制破骨细胞的分化。经研究证实这两组miRNA与单核细胞特异性基因和免疫调节相关基因(如TNFAIP3、IGF1R和IL15)结合，并抑制它们的表达。单核细胞特异性基因和免疫调节相关基因对单核细胞向破骨细胞分化具有抑制作用，NF-ΚB通过与miRNA-212/132和miRNA-99b/let-7e/125a的启动子结合上调其水平, 使这些miRNA抑制靶基因的表达，从而促进破骨细胞分化。
某些miRNA还可以通过与不同的基因位点结合来调控不同细胞的功能。miRNA-214不仅可通过与ATF4基因结合抑制成骨细胞分化，还可通过激活Pten/PI3k/Akt通路促进破骨细胞生成[32]。miRNA-214在RANKL诱导的BMM向破骨细胞分化过程中表达水平增加，使其过表达可促进破骨细胞分化，抑制其表达则会抑制破骨细胞分化。体内实验表明，向破骨细胞特异性转入miRNA-214的小鼠会出现同源性磷酸酶-张力蛋白(Pten)水平下降、破骨细胞活动增强、骨密度降低。Pten调节的RANKL诱导的破骨细胞分化经PI3K/Akt信号通路进行，因此，miRNA-214通过与Pten基因结合来激活PI3K/Akt信号通路，从而促进破骨细胞分化。
负向调控骨吸收的miRNA活化T细胞细胞质1核因子(NFATc1)是RANKL信号通路刺激破骨细胞分化的过程中关键的转录因子。Lee等[33]发现BMM中miRNA-124可通过阻断靶基因NFATc1的表达调控破骨细胞生成。给予人工合成的miRNA-124抑制剂可促进破骨细胞分化和NFATc1表达，而NFATc1的过表达则可阻断miRNA-124对破骨细胞生成的抑制作用。此外，miRNA-124还可通过抑制Ras同源基因家族成员A(RhoA)和Ras相关C3肉毒杆菌毒素基质1(Rac1)的表达来抑制破骨细胞前体的增生。另有研究发现同源结构域转录因子3(DLX3)通过miRNA-124抑制破骨细胞分化[34]。测定DLX3在破骨细胞分化过程中的表达情况，建立稳定的野生型表达的DLX3(WT-DLX3)和新型的突变DLX3(MT-DLX3), 并通过转入慢病毒在Raw 264.7细胞系建立Dlx3敲除模型(Dlx3-shRNA)，随后对比前述细胞系破骨细胞分化的改变，结果发现破骨细胞生成相关基因的表达和抗酒石酸酸性磷酸酶阳性(TRAP+)细胞数量在WT-DLX3和MT-DLX3细胞中较少，而在Dlx3-shRNA细胞中较多，说明DLX3抑制破骨细胞分化。同时发现过表达DLX3会引起miRNA-124水平升高并抑制骨吸收，敲除DLX3则引起miRNA-124水平降低，骨吸收增加。证明DLX3可通过提高miRNA-124水平抑制破骨细胞分化。
Chen等[35]发现与绝经后健康妇女相比，绝经后骨质疏松症妇女的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中miRNA-503显著下降。PBMC是破骨细胞祖细胞，miRNA-503在PBMC中过表达对RANKL诱导的破骨细胞生成具有抑制作用。反之，抑制miRNA-503的表达则会促进破骨细胞生成。RANK作为肿瘤坏死因子家族中的一员，主要在单核/巨噬细胞系(如前破骨细胞和破骨细胞)中表达，可促进破骨细胞分化。研究表明RANK是miRNA-503的直接抑制靶点。在卵巢切除(ovariectomized, OVX)的大鼠模型中应用特殊拮抗药物来增强RANK蛋白的表达，OVX大鼠表现为miRNA-503水平无变化，骨吸收增加，骨量降低；而过表达miRNA-503则会抑制骨吸收，增加骨量。故miRNA-503不仅抑制破骨细胞生成，其水平改变在骨质疏松症的病理生理过程中起到重要标志性作用。
低氧环境可以促进破骨细胞生成并增强骨吸收，Sun等[36]发现miRNA-20a和细胞自噬共同参与此过程。自噬和自噬相关蛋白(autophagy-related protein, ATG)通过HIF-1α/BCL2/腺病毒E1B 19kd-BNIP3通路发挥作用，miRNA-20a过表达后，低氧条件下自噬相关蛋白ATG16L1和破骨细胞分化标志物均显著下调。双荧光素酶报告基因系统证明ATG16L1为miRNA-20a的直接作用靶点，染色质免疫沉淀分析结果显示miRNA-20a还可与HIF-1α相结合，敲除HIF-1α后，细胞中自噬相关蛋白和破骨细胞标志物均显著下调。提示HIF-1α-miRNA-20a-ATG16L1可能是低氧诱导的破骨细胞分化的关键机制，miRNA-20a和自噬可以共同调控低氧环境下的破骨细胞分化。
miRNA还可通过诱导破骨细胞死亡来抑制骨吸收。Fordham等[37]发现RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，miRNA-142-3p的表达水平明显改变。在单核细胞向破骨细胞、巨噬细胞以及树突状细胞分化的过程中，转入miRNA-142-3p类似物可显著抑制细胞间建立联系、细胞融合、蛋白激酶Cα的表达以及破骨细胞和树突状细胞的生成，并最终导致细胞活性降低。
此外，miRNA还可以通过与不同的基因位点结合发挥调控作用。有研究发现miRNA-26a是骨质疏松症中参与调控骨组织形成的关键因子，可通过结合具有抑制骨形成的作用的调节因子Tob1基因来抑制Tob1相关蛋白的表达，从而参与调控骨组织形成[38]。而Kim等[28]则发现miRNA-26a还参与调控RANKL通路激活的破骨细胞生成。miRNA-26a类似物应用于前破骨细胞可抑制破骨细胞生成、肌动蛋白环的形成，并且可通过作用于结缔组织生长因子/CCN家族2(CTGF/CCN2)来抑制骨吸收，后者通过上调树突细胞特异性跨膜蛋白(dendritic cell-specific transmembrane proteins, DC-STAMP)促进破骨细胞生成；而抑制miRNA-26a则使RANKL激活的破骨细胞生成增加，破骨细胞功能得到促进，CTGF表达也有所增加。故miRNA-26a通过作用于CTGF来调节破骨细胞的分化和功能。
综上，越来越多的miRNA被发现参与破骨细胞增生、分化、凋亡、细胞融合和骨吸收，其中大部分miRNA对破骨细胞的生成和成熟发挥促进或抑制作用，少部分参与对破骨细胞功能的调控。由于可以反映破骨细胞活动状态以及骨质吸收情况，因此，miRNA具有作为骨质疏松症生化标志物的巨大潜力，但仍需大规模前瞻性研究来验证。
展望miRNA通过结合靶基因上的相应位点来抑制目的基因的翻译，参与机体的多种病理生理过程。miRNA表达的上调与下调不仅可以发挥生物学效应，同时亦可作为组织或血清中可测量的生物标志物来反映机体骨代谢状态，为骨代谢疾病的新型治疗方法提供分子基础。血清miRNA因具有取材方便、易于测量的优点，所以有研究建议未来可应用miRNA评估骨脆性，并作为评估骨折风险的临床工具[5]。然而，miRNA变异性大，且种类、数目繁多，发挥作用的通路尚未完全明确，目前还难以用于临床诊治。找到骨代谢相关的miRNA所具有的共性，将多种miRNA进行分类、归纳，而不是局限于单个miRNA的功能，也许是推进其临床应用的重要环节。miRNA与骨质疏松症之间的关系目前尚未阐明，进一步深入探究miRNA在骨形成和骨吸收中的作用机制，可推进其作为新型生物学标志物的应用，以及为临床诊治骨质疏松症提供新思路。
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| (收稿日期：2017-03-01) |